Molekulare Mechanismen der Tyrosin-Nitrierung

Stickstoffmonoxid (NO) hat wichtige biologische Funktionen als zellulärer Botenstoff, führt aber bei Überproduktion im Rahmen von entzündlichen und infektiven Erkrankungen zu einer Schädigung des betroffenen Gewebes. Ein wesentlicher Mechanismus der NO-vermittelten Zytotoxizität ist die Reaktion von NO mit Superoxid-Anionen (O2 .- ) zu Peroxynitrit, einem starken Oxidans und Zytotoxin. Peroxynitrit ist möglicherweise der wesentliche Mediator der Zytotoxizität von NO bei Atherosklerose, Herzinfarkt, Apoplexie (Schlaganfall) und anderen Erkrankungen, die mit verstärktem oxidativen Streß einhergehen. In vitro reagiert Peroxynitrit mit fast allen Klassen von Biomolekülen. Die Reaktion mit freiem oder proteingebundenem Tyrosin resultiert in der Bildung von 3-Nitrotyrosin, einem Molekül dessen Nachweis in geschädigten Geweben häufig als Marker für Peroxynitrit-Bildung in vivo herangezogen wird. Kürzlich wurden allerdings alternative Mechanismen der Tyrosin- Nitrierung beschrieben, und wir konnten zeigen, daß NO/ O2 .- -generierende Systeme im Gegensatz zu Peroxynitrit keine Nitrierung von freiem Tyrosin bewirken. Im Rahmen des vorliegenden Projektes sollen molekulare und zelluläre Mechanismen der Tyrosinnitrierung bei entzündlichen und ischämischen Prozessen untersucht werden. Bisher wurden solche Untersuchungen nahezu ausschließlich mit synthetischem Peroxynitrit durchgeführt, also ein experimenteller Ansatz gewählt bei dem die in vivo-Situation, d.h. die kontinuierliche Generierung von NO und O2 .- aus unterschiedlichen zellulären Quellen, nicht berücksichtigt wird. Daher soll im ersten Teil des Projektes die Tyrosinnitrierung in Zellen untersucht werden, in denen die Bildung von NO und O 2 .- durch Zugabe selektiver Stimuli der entsprecheden Stoffwechselwege unabhängig voneinander angeschaltet werden kann. Im zweiten Teil des Projektes sollen die funktionellen Konsequenzen der Tyrosinnitrierung in einem experimentellen Modell der kardialen Ischämie (Herzinfarkt) untersucht werden. Dazu sollen die Gewebespiegel an 3-Nitrotyrosin in Herzen genetisch veränderter Mäuse nach globaler Ischämie und Reperfusion gemessen und mit den entsprecheden funktionellen Parametern korreliert werden, um einen möglichen kausalen Zusammenhang zwischen Tyrosinnitrierung und gestörter Herzfunktion nachweisen zu können. Insgesamt sollten die geplanten Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der Tyrosinnitrierung sowie zur Entwicklung neuartiger Therapieschemata zur Behandlung von Erkrankungen des entzündlich-infektiven Formenkreises beitragen.

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein weit verbreitetes Signalmolekül, das an so unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt ist wie der Regulation des Blutdrucks, der Aggregation von Blutplättchen, der Neurotransmission im Gehirn, der Peniserektion und der Immunisierung gegen Pathogene. Neben diesen wichtigen physiologischen Funktionen hat NO auch schädliche Wirkungen, und dessen Überproduktion ist an der Entstehung zahlreicher entzündlicher, infektiver und neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt. Im Unterschied zu anderen zellulären Signalmolekülen, die über spezifische Interaktionen mit Bindungsstellen von Zielproteinen wirken, beruhen die biologischen Effekte von NO auf chemischen Reaktionen mit Zellbestandteilen, sodass für das Verständnis der biologischen Wirkungen von NO die Kenntnis der biologisch relevanten chemischen Reaktionen entscheidend ist. Eine wesentliche, an toxischen NO-Wirkungen beteiligte Reaktion von NO ist die Bildung von Peroxynitrit, einem reaktiven Molekül, das durch Modifikation zellulärer Proteine schädigend wirkt. Im Rahmen dieses Projekts haben wir den Mechanismus und die biologische Relevanz der Nitrierung von Tyrosin- Resten zellulärer Proteine untersucht. Wir konnten zeigen, dass Peroxynitrit in niedrigen Gleichgewichtskonzentrationen wie sie bei der in situ Generierung in Zellen vorliegen, keine nennenswerte Tyrosinnitrierung bewirkt, und haben daher nach alternativen Nitrierungs-Reaktionen gesucht. Dazu haben wir die Nitrierung zunächst in einer Zytokin-aktivierten Makrophagen-Zellinie untersucht und beobachtet, dass die Nitrierung durch Hemmstoffe des Enzyms Myeloperoxidase aber nicht durch Peroxynitrit-Scavenger blockiert wird. Ausserdem beobachteten wir eine zeitliche Korrelation der Proteinnitrierung mit der Bildung von Nitrit, dem Substrat der Myeloperoxidase-katalysierten Reaktion, aber nicht mit der Bildung von Peroxynitrit. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die zelluläre Proteinnitrierung nicht durch Peroxynitrit ausgelöst wird, sondern auf Myeloperoxidase-katalysierter Oxidation von Nitrit beruht. Aufgrund dieser Resultate haben wir die Tyrosin- Nitrierung auch in isolierten Peritoneal-Makrophagen von Mäusen untrersucht, wobei die Zellen entweder in vitro durch Zytokine aktiviert wurden oder aber aus Mäusen gewonnen wurden, die durch Behandlung mit C. parvum einer systemischen Entzündung unterzogen worden waren. In beiden Modellen beobachteten wir eine nahezu vollständige Hemmung der Peroxynitrit-Bildung durch den etablierten Scavenger MnTBAP, wohingegen die Tyrosin-Nitrierung durch diese Substanz kaum beeinflusst wurde. Ähnlich wie mit der Makrophagen-Zellinie war auch in den frisch isolierten Peritoneal-Makrophagen die Nitrierung gegenüber der Peroxynitrit-Bildung zeitlich stark verschoben. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass die Nitrierung zellulärer Proteine sowohl in vitro als auch in vivo durch Myeloperoxidase oder andere Häm-Peroxidasen katalysiert wird. Selektive Hemmstoffe dieser Enzyme könnten demnach therapeutische Verwendung für die Behandlung verschiedener entzündlich-infektiver Erkrankungen finden.