c-erbB-3: ein Kernprotein?

Forschungsprojekt P 13622c-erbB-3: Ein KernproteinThomas W. GRUNT28.06.1999 C-erbB-3 wird - wie die übrigen c-erbB Rezeptoren - allgemein als Transmembranrezeptor-Tyrosinkinase betrachtet, die durch extrazelluläre Bindung von Heregulin (HRG), einem EGF-ähnlichen Wachstumsfaktor, aktiviert werden kann. Unsere vorläufigen Daten zeigen, daß in den Zellkernen einer nicht-malignen humanen Mammaepithelzellinie (MTSVI-7) und in den Kernen primärer humaner Mammaepithelzellen hohe Mengen an c- erbB-3 vorliegen, während hingegen in malignen Zellinien, wie BT-474 und SK-BR-3, c-erbB-3 im Zytoplasma und. an der Zellmembran gefunden wird. Übereinstimmend mit diesen Befunden zeigte Durchflusszytometrie ein völliges Fehlen von c-erbB-3 an der Zellmembran von normalen, nicht aber von transformierten. Zellen. Weiters konnten wir zeigen, daß in nicht-malignen Zellen, der c-erbB-3 Ligand HRG eine Verlagerung von c-erbB-3 aus dem Zellkem in zytoplasmatische Vesikel verursacht. Dieser Effekt wurde nur in Zellkultursystemen beobachtet, die die epitheliale Zellpolarität und Differenzierung erhalten, wie permeable Filteroberflächen oder 3D- Kollagengele. Diese Beobachtungen über die subzelluläre Lokalisierung von c-erbB-3 in Abhängigkeit von exogenen Stimuli und vom Differenzierungszustand der Zelle, stellen die spezifische Funktion von c-erbR-3 alsTransmembranrezeptor in Frage und sprechen für zusätzliche, bisher unidentifizierte, Aufgaben für c-erbB-3 innerhalb der Zelle. Eine Kombination von biochemischen, zellbiologischen und molekularbiologischen Strategien soll verwendet werden, um ein klares Bild der Bedeutung der beobachteten nukleären/zytoplasmatischen Verteilung von c-erbB-3 zu zeichnen. Koimmunpräzipitation und Immunoblot von nukleären und zytoplasmatischen Extrakten soll durchgeführt werden, um mögliche Interaktionspartner von c-erbB-3 zu identifizieren und um den Phosphorylierungsgrad von c-erbB-3 und seiner Bindungspartner zu bestimmen. Um die subzelluläre Verteilung von c-erbB-3 detailliert zu untersuchen und um mögliche nukleäre Lokalisierungssignale (NLSs) innerhalb des c-erbB-3 Proteins zu kartieren, sollen transfizierte MTSVI-7 Zellen zum Einsatz kommen, die verschiedene Teile von c-erbB-3 fusioniert mit "enhanced green fluorescent protein" (EGFP - ein fluoreszierendes Protein) exprimieren. Die auf diese Weise identifizierten NLSs sollen sodann durch "Site-Directed Mutagenesis" verändert werden und es sollen die zellbiologischen. Konsequenzen dieser molekularen Veränderungen analysiert werden. Zusätzlich sollen Inhibierungsexperimente mit Leptomycin B - einem Inhibitor des nukleären Exports - klären, ob HRG Inhibierung des nukleären Imports oder Aktivierung des nukleären Exports hervorruft. "Soft Agar" Wachstumstests von MTSVI-7 Transfektanten, die mutiertes (zytoplasmatisches) oder Wildtyp c-erbB-3 stabil exprimieren, sollen klären, ob das Auftreten von zytoplasmatischem c-erbB-3 im Zusammenhang mit maligner Transformation von Brustepithelzellen steht. Weiters soll Durchflusszytometrie zeigen, ob die durch HRG induzierte zytoplasmatische Anreicherung von c-erbB-3 auch mit einem Ansteigen der Membranexpression einhergeht. Die vorgeschlagenen Experimente sollen zu einem besseren Verständnis der Funktion von c-erbB-3 beim Wachstum, bei der Differenzierung und bei der malignen Transformation von humanen Mammaepithelzellen beitragen.

Die Familie der erbB Wachstumsfaktor-Rezeptorproteine umfaßt 4 Mitglieder: erbB-1 bis -4. erbB-1 ist besser bekannt als Epidermal Growth Factor Receptor, erbB-2 wird auch HER-2/neu, erbB-3 HER-3, und erbB-4 HER-4 genannt. Diese Proteine befinden sich in der Zellmembran und dienen als Andockstellen für spezifische extrazelluläre Wachstumsfaktoren. Bindung des Wachstumsfaktors aktiviert den Rezeptor und löst eine Reihe von Enzymreaktionen im Zytoplasma aus. Dadurch wird das durch den Wachstumsfaktor an die Zelle heran getragene Signal` in enzymatische Prozesse umgewandelt, die spezifische zytoplasmatische Substratproteine aktivieren. Das letzte Protein in der Abfolge ist ein Transkriptionsfaktor, der in den Zellkern gelangt und die Expression von Genen moduliert, die Zellwachstum und Zellreifung kontrollieren. Dieser Prozess, als Signaltransduktion` bezeichnet, führt zu kurz andauernden biochemischen Veränderungen, welche die Zelle befähigen, schnell auf externe Reize zu reagieren. Dieses klassische Modell kann jedoch nicht alle Wirkungen von Wachstumsfaktoren erklären wie z.B. konstant gesteigertes Zellwachstum. Deshalb stellten wir die These auf, daß erbB Rezeptoren zusätzliche, bis jetzt unbekannte Funktionen im Zellkern ausüben. Hier haben wir uns auf erbB-3 konzentriert, das gemeinsam mit erbB-2 bei vielen Krebserkrankungen inkl. Brustkrebs erhöht auftritt und einen schwereren Verlauf der Erkrankung verursacht. In kultivierten normalen Brustzellen und Brustkrebszellen fanden wir erbB-3 innerhalb des Zellkerns, wobei die Lokalisation vom Grad der Differenzierung und von den Kulturbedingungen abhängt. Ein erbB-3 bindender Wachstumsfaktor (Heregulin) z.B. verlagert erbB-3 aus dem Zellkern ins Zytoplasma und zur Zellmembran. Unter Heregulin-freien Bedingungen wurde erbB-3 in den Nukleoli gefunden. Diese Kern- Substrukturen kontrollieren die Synthese von Komponenten, die für die Proteinproduktion benötigt werden. Wir konnten somit erstmals zeigen, daß erbB-3 nicht nur ein membranständiger Rezeptor ist, der die klassische Signaltransduktion auslöst, sondern als Kernprotein zusätzliche Funktionen im Zellkern ausübt. Dadurch kommt es betreffend die Funktionen von erbB-3 in der Zelle zu einem Paradigmenwechsel, der Auswirkungen auf die molekulare Medizin und auf die Entwicklung von Krebsmedikamenten haben wird.