3D Rekonstruktionen von Organellen und deren Feinstrukturen

Forschungsprojekt P 136143D Rekonstrukionen von Organellen und deren FeinstrukturenGünther ZELLNIG28.06.1999 Das Transmissions Elektronen Mikroskop wird häufig zur 2D Strukturaufklärung von Zellorganellen und deren Feinstrukturen (SITTE 1991, SMITH & WOOD 1996) eingesetzt. Bei herkömmlichen Untersuchungen ist es jedoch nicht möglich, vollständige Organellen zu erfassen, da nur mit wenigen Ultradünnschnitten von 80-100 mm Dicke gearbeitet wird, Chloroplasten aber z. B. eine Länge von 4 - 8 mm aufweisen. Mit der von uns angewendeten Methode (ZELLNIG et al. 1996, PERKTOLD et al. 1998) sind 2D Messungen und 3D Ansichten von Organellen realisierbar, die auf der Rekonstruktion von Seriendünnschnitten beruhen. Es können Strukturen (Organellen oder deren Utrastrukturkomponenten) gezielt ausgeblendet werden, wodurch das betrachtete System übersichtlicher wird. Die selektierten Strukturen können von jeder beliebigen Seite betrachtet werden, dadurch sind genaue Aussagen über die räumliche Architektur möglich. Zu den dargestellten Zellorganellen sind zusätzlich durch digitale Bildanalyse auch Flächen- bzw. Volumsdaten (z. B. des Thylakoidsystems, des Stromas und der Stärke von Plastiden) verfügbar, In diesem Zusammenhang ist es wichtig darauf hinzuweisen, daß tatsächlich existierende Zellstrukturen rekonstruiert werden und keine Modelle erstellt werden. Zellorganellen und deren Ultrastruktur können durch Streßfaktoren beeinträchtigt oder verändert werden (FINK 1988, BÄCK et al. 1994). Diesbezüglich sind hauptsächlich Plastiden untersucht worden, da diese Organellen schon frühzeitig Veränderungen/Störungen zeigten. Die Beurteilung des Zustandes basierte aber auf nur wenigen Einzelschnitten und meistens wurden tagesperiodische Schwankungen nicht berücksichtigt. Andere Organellen wie Mitochondrien oder Peroxisomen sind wegen ihrer kleineren Dimensionen noch schwieriger mit konventionellen Methoden zu untersuchen. Es ist praktisch nur mit dreidimensionalen Daten möglich, Veränderungen in der Feinstruktur von Organellen sinnvoll festzustellen und in weiterer Folge, Schädigungen von tagesperiodischen Schwankungen zu unterscheiden. Mit unseren Untersuchungen beabsichtigen wir, die 3D Ultrastruktur pflanzlicher Zellorganellen zu unterschiedlichen Tageszeiten zu erfassen. Dies soll an bestimmten Pflanzen (Picea abies, Pinus canariensis und Spinacia oleracea) unter definierten Bedingungen in Klimakammern geschehen. Darüber hinaus soil der Einfluß von Trockstreß mitberücksichtig werden. Die gewonnenen Daten sollen sowohl zur Erfassung struktureller Charakteristika, dienen, als auch eine bessere funktionelle Interpretation physiologischer und biochenfischer Daten ermöglichen.

Chloroplasten der drei Arten Spinat, Fichte und Kiefer stehen im Mittelpunkt dieses Projektes. Das sind jene Strukturen in den Zellen grüner Blätter, in denen die Photosynthese abläuft. Das ist jener Prozess, bei dem die Energie der Sonnenstrahlen in chemische Energie in Form von Kohlenhydraten umgewandelt wird. Da die Feinstrukturen der Chloroplasten nur mit dem Transmissions Elektronen Mikroskop (TEM) sichtbar gemacht werden können, werden die Organellen in sehr dünne Schnitte (Ultradünnschnitte) von einem zehntausendstel Millimeter Dicke geschnitten, mikroskopiert und mit-tels Computer dreidimensional rekonstruiert. Diese aufwendige Prozedur ermöglicht es erstmals kom-plette Chloroplasten dreidimensional darzustellen und deren Feinstrukturen quantitativ zu erfassen. Durch die gewonnenen Ergebnisse können tagesperiodische Schwankungen von Schädigungen, die z. B. durch Trockenstress herbeigeführt werden, unterschieden werden, ohne dass diese mit freiem Auge schon erkennbar sind. In den von uns untersuchten Pflanzen konnten deutliche Unterschiede innerhalb der Chloroplasten im Tagesverlauf und unter Streß festgestellt werden, wobei sich die untersuchten Pflanzen nicht gleich verhielten. Diese Daten stellen grundlegende Erkenntnisse für künftige Untersu-chungen dar. Bei herkömmlichen Untersuchungen mit dem TEM ist es nicht möglich, vollständige Organellen zu erfassen, da nur mit wenigen Ultradünnschnitten von 80-100 nm Dicke gearbeitet wird, Chloroplasten aber z. B. eine Länge von 4-8 m aufweisen. Zellorganellen und deren Ultrastruktur können durch Streßfaktoren beeinträchtigt oder verändert werden. Diesbezüglich sind hauptsächlich Plastiden (Chloroplasten) untersucht worden, da diese Organellen schon frühzeitig Veränderungen bzw. Stö-rungen zeigten. Die Beurteilung des Zustandes basierte aber auf nur einigen Einzelschnitten und meis-tens wurden mögliche tagesperiodische Schwankungen nicht berücksichtigt. Andere wichtige Zellor-ganellen wie Mitochondrien oder Peroxisomen sind wegen ihrer kleineren Dimensionen von ca. 0,5 - 2 m noch schwieriger mit konventionellen Methoden zu untersuchen. Es ist praktisch nur mit den im Projekt erarbeiteten dreidimensionalen Daten möglich, Veränderungen in der Feinstruktur von Orga-nellen sinnvoll festzustellen und in weiterer Folge, Schädigungen von tagesperiodischen Schwankun-gen zu unterscheiden. Mit der von uns angewendeten und im Rahmen des Projektes weiterentwickelten Methoden sind 2D Messungen und 3D Ansichten von Organellen realisierbar, die auf der Rekonstruktion von Ultradünn-schnittserien beruhen. Es können Strukturen (Organellen oder deren Feinstrukturen) gezielt ausge-blendet werden, wodurch das betrachtete System übersichtlicher wird. Die selektierten Strukturen können von jeder beliebigen Seite betrachtet werden, dadurch sind genaue Aussagen über die räumli-che Architektur möglich. Zu den dargestellten Zellorganellen (Chloroplasten, Mitochondrien, Peroxi-somen) sind zusätzlich durch digitale Bildanalyse auch Flächen- bzw. Volumsdaten (z. B. des Thyla-koidsystems oder der Stärke von Chloroplasten) verfügbar. In diesem Zusammenhang ist es wichtig darauf hinzuweisen, daß tatsächlich existierende Zellstrukturen rekonstruiert werden und keine Mo-delle erstellt werden. Die gewonnenen Daten dienen sowohl der Erfassung struktureller Charakteristika, als auch als Grund-lage für eine exaktere Interpretation physiologischer und biochemischer Vorgänge.