Charakterisierung von NO-Synthasen

Stickstoffmonoxid (NO) stellt ein weitverbreitetes intra- und interzelluläres Signalmolekül dar, d.h. hormonale Primärsignale werden durch NO an intrazelluläre Effektor-Systeme weiterleitet. In Endothelzellen und im Gehirn bewirkt NO eine Aktivierung der löslichen Guanylyl-Cyclase und somit einen Anstieg des Gehaltes an intrazellulärem cGMP, einem zyklischen Nukleotid. das durch Aktivierung von Proteinkinasen Phosphorylierungs- Reaktionen und damit die Zellantwort (z.B. Gefäßerweiterung oder Freisetzung von Neurotransmittern auslöst. Im Rahmen des vorliegenden Projektes werden wir unsere langjährigen Untersuchungen zur Funktion und physiologischen Regulation von NO-bildenden Enzymen (NO-Synthasen; NOS) weiterführen, die zu einem besseren Verständnis der Biosynthese von NO beitragen sollen. Langfristig sollten diese Arbeiten neue Möglichkeiten zur Therapie von Erkrankungen aufzeigen, die mit einer gestörten NO-Bildung in verschiedenen Geweben einhergehen. NOS-Isoformen sind sehr komplex aufgebaute Proteine, die in einer nur zum Teil verstandenen Redox-Reaktion die Aminosäure L-Arginin zu L-Citrullin und NO umwandeln. Für die geplanten Untersuchungen werden verschiedene NOS-Isoformen (neuronale, endotheliale und induzierbare NOS) gentechnologisch hergestellt, in kultivierten Insektenzellen überexprimiert, aus diesen Zellen isoliert, und biochemisch-biophysikalisch charakterisiert. Als Schwerpunkte des Projektes sind vor allem die Aufklärung der noch unbekannten Funktion des Pterin- Kofaktors der NOS, Tetrahydrobiopterin und experimentelle Untersuchungen zur Rolle der prosthetischen Häm- Gruppe bei der Assoziation von inaktiven NOS-Untereinheiten zu aktiven Homodimeren zu nennen. Zur Untersuchung der Funktion des Pterin-Kofaktors werden sowohl strukturelle als auch funktionelle Effekte synthetischer Analoga des natürlichen Kofaktors bestimmt, um die spezifischen Strukturelemente dieser Verbindungen kennenzulernen, die für die Bindung an die Pterin-Bindungsstelle des Enzyms sowie für dessen nachfolgende Aktivierung verantwortlich sind. Für die Studien zur Funktion der prosthetischen Häm-Gruppe werden verschiedene Metall-Porphyrine auf Bindung an NOS, Protein-Dimerisierung und Ausbildung hochaffiner Substrat- und Kofaktor-Bindungsstellen untersucht. Durch Verwendung definierter Mutanten der NOS-Isoformen können in diesen Experimenten auch die erforderlichen strukturellen Eigenschaften des Proteins bestimmt werden.

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein weit-verbreitetes Signalmolekül, das an so unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt ist wie der Regulation des Blutdrucks, der Aggregation von Blutplättchen, der Neurotransmission im Gehirn, der Peniserektion und der Immunisierung gegen Pathogene. Neben diesen wichtigen physiologischen Funktionen hat NO auch schädliche Wirkungen, und dessen Überproduktion ist an der Entstehung entzündlicher, infektiver und neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt. Daher sind sowohl spezifische NO- Donatoren als auch Hemmstoffe der NO-Bildung als potentielle neue Arzneistoffe zu betrachten, die zur Therapie verschiedener Erkrankungen eingesetzt werden könnten. Das vorrangige Ziel dieses Projektes war ein besseres Verständnis der Mechanismen der NO-Biosynthese und deren körpereigener Regulation. Die Umwandlung der Aminosäure Arginin zu NO wird durch eine Familie hochkomplexer Enzyme, den NO-Synthasen, katalysiert. NO-Synthasen enthalten mehrere redox-aktive Kofaktoren. Im katalytischen Zentrum der Enzyme bewirkt eine P450-Häm-Gruppe durch reduktive Aktivierung von molekularem Sauerstoff die zweistufige Oxidation von Arginin zu NO und Citrullin. Im Unterschied zu anderen Monooxygenasen benötigen NO-Synthasen für diese Reaktion aber den Pterin-Kofaktor Tetrahydrobiopterin, dessen Funktion zu Beginn des Projekts noch weitgehend unklar war. Untersuchungen mit synthetischen Tetrahydrobiopterin-Analoga zeigten, dass der Pterin-Kofaktor nicht nur allosterische Effekte auf die Proteinkonformation ausübt sondern katalytisch an der Oxidation von Arginin beteiligt ist, dabei aber nicht wie in anderen Pterin-abhängigen Enzymen als 2-Elektronen-Donor fungiert. Zusammen mit Gruppen in Montpellier und Oslo konnten wir zeigen, dass Tetrahydrobiopterin während der Katalyse in einen transienten Radikalzustand übergeht und dabei ein Elektron an die Häm-Gruppe abgibt, das für die reduktive Sauerstoffaktvierung und damit die Oxidation von Arginin wesentlich ist. Diese von uns bereits früher vorgeschlagene und nun bestätigte Funktion von Tetrahydrobiopterin als 1-Elektronen-Donor ist in der Biologie einzigartig und beruht vermutlich auf der Sonderstellung der NO-Synthasen unter den P450-Enzymen. Im klassischen P450-Zyklus entstehen maßgebliche Mengen von Superoxid-Anionen. Die Bildung dieser reaktiven Sauerstoffspezies ist bei anderen P450-Reaktionen unkritisch, würde aber zu einer raschen Inaktivierung von NO führen. Durch schnellen, lokal eng begrenzten Transfer eines Elektrons vom Pterin-Kofaktor zur Häm-Gruppe wird die Superoxid-Bildung durch NO-Synthasen sehr effizient verhindert. Interessanterweise zeigen klinische Studien, dass die bei vielen Herz-Kreislauf- Erkankungen verminderte NO-Bildung eine Folge von erniedrigten zellulären Pterin-Spiegeln und der damit eingergehenden Superoxid-Bildung durch endotheliale NO-Synthase ist. In Folgeprojekten versuchen wir nun diese Zusammenhänge aufzuklären und neue therapeutisch relevante Pterin-Analoga zu entwickeln.