Zellulärer Energiemetabolismus bei PDT

Die Photodynamische Lasertherapie (PDT: Photosensibilisatoren akkumulieren selektiv in Tumorgewebe und zerstören dieses bei Aktivierung mit sichtbarem Licht) ist als neuer Ansatz der Krebsbehandlung seit vielen Jahren erfolgreich im Einsatz und bereits in verschiedenen Ländern für diverse Tumorarten zugelassen. Wie in anderen Tumortherapien auch kann hier Zelltod über Apoptose durch reduzierte Sensibilisator- und/oder Lichtdosen ausgelöst werden, was die Wirksamkeit steigern und Nebeneffekte vermindern sollte. Im Gegensatz dazu stimuliert Nekrose das Immunsystem, eine wichtige Komponente in der Tumorzerstörung. Die hohe Effizienz der PDT dürfte auf dem gemessenen Auftreten von beiden Zelltod-Arten beruhen. Daher ist es von großem Interesse, die zum Zelltod führenden Mechanismen zu erforschen und kontrollieren. Mitochondrien scheinen Regulatoren der Apoptose zu sein, und die intrazelluläre ATP-Konzentration könnte die Art des Zelltodes bestimmen oder dessen Programme entscheidend beeinflussen. Ziel des vorliegenden Forschungsprojektes ist es deshalb, die Energiehomeostase für die zum Zelltod durch PDT führenden Prozesse zu untersuchen und zu kontrollieren, um die Wirksamkeit und Sicherheit der PDT zu erhöhen. Die Manipulation der "Todes-Programme" sollte möglich sein, indem die Signalübertragungswege indirekt über das überlagerte Energiemuster (= räumliche und zeitliche ATP-Verteilung) beeinflußt werden. Die Produktion von ATP kann stark durch reaktive Sauerstoff-Arten (ROI), wie in der PDT erzeugt, beeinflußt worden. Speziell der in den Mitochondrien entstehende endogene Photosensibilisator Protoporphyrin IX (PptX) könnte den ATP-Vorrat durch ROI beeinflussen. Das wiederum könnte Signaltransduktion mit Botschaften für Regulierungsänderungen der Zellproliferation und für Zelltod-Induktion initiieren. Der Hauptteil des Projektes stellt die Messung des Energiemetabolismus (Verteilung, Homeostase und Energie- Dynamiken durch kontinuierliches Aufzeichnen) in Einzelzellen unter besonderer Berücksichtigung der Mitochondrien dar. Messung und Auswertung der metabolischen Reaktion (ATP, ADP, AMP = Energieladung; Ca2+) von transformierten Maus-Fibroblasten (L929) wird über Chemoluminiszenz mit einem Low-Light-Imaging- System und mit zeitaufgelöster Schwachlicht-Fluoreszenzanalyse durchgeführt. Die Zellen werden mit jenen Genen stabil transfiziert, deren Genprodukte (Luciferase, Aequorin) die Luminiszenzreaktionen katalysieren. Der Energiemetabolismus wird nach photodynamischer Behandlung mit endogenem PpIX und unter verschiedenen Kontrollbedingungen gemessen. Es soll untersucht werden, ob die verschiedenen Zustände der Zelle, die beiden Arten des Zelltods und die verschiedenen Arten der Apoptose durch die Energieladung voneinander unterschieden oder sogar beeinflußt werden können. Die Erzeugung von ROI durch PDT soll an L929 und normalen Maus- Fibroblasten (3T3) hinsichtlich intrazellulärer Strukturen und Sensibilisator-Verteilung gemessen und mit dem Energiemetabolismus korreliert werden. Es soll untersucht werden, inwieweit die verschiedenen energetischen Zustände der Zelle und die beiden Zelltod-Arten von ROI beeinflußt oder sogar verursacht werden. Zusätzlich werden das mitochondriale Membran-Potential und Cytochrome c-Ausstrom gemessen, um deren Rolle in photodynamisch induziertem Zelltod zu untersuchen. Als Ergebnis der Untersuchungen sollten die die Zelltod-Prozesse beeinflussenden Faktoren für eine Manipulation hinsichtlich eines optimierten Verhältnisses von Apoptose/Nekrose verwendet werden können. Dies sollte zu einem in der Klinik anwendbarem PDT-Protokoll mit der Aussicht auf Verbesserung des therapeutischen Erfolges führen.

Zusammenfassung: Eine Grundvoraussetzung für die Durchführung der Apoptose ist eine funktionierende Energieversorgung der Zelle. Dabei wird ATP durch Glykolyse bereitgestellt. Nekrotische Zellen verlieren ATP rasch und vollständig. Demnach stellt die zelluläre Energetik einen wichtigen Parameter dar, der das Verhältnis zwischen Apoptosen und Nekrosen nach photodynamischer Therapie bestimmt und, durch Modifikation derselben, auch die Effektivität der Tumortherapie durch Stimulation des Immunsystems beeinflussen kann. Kurzfassung: Die Photodynamische Therapie stellt eine relative neue Methode zur Behandlung vieler maligner und nicht-maligner Krankheitsbilder dar. Sie beinhaltet die bevorzugte Aufnahme eines Photosensitizers in die Target- Zellen und die nachfolgende Bestrahlung mit sichtbarem oder infrarotem Licht. Hierdurch werden reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produziert, welche durch Oxidation der Zellinhalte zum Zelltod führen. Dabei löst die PDT effektiv beide Arten des Zelltodes - Apoptose und Nekrose - aus. Apoptose stellt - im Gegensatz zur passiven Nekrose, die durch superlethale Schädigung von Zellen in den meisten Fällen sehr rasch zum Verlust des metabolischen Gleichgewichts und der Zellmembranintegrität führt - einen aktiven und hochgeregelten Prozeß dar, der zudem an die Verfügbarkeit von Energie gebunden ist. Zahlreiche Schritte im Ablauf der Apoptose sind direkt an das Vorhandensein von ATP gebunden. Ziel des vorliegenden Projekts war es, die Zelltodarten nach PDT besonders unter dem Gesichtspunkt der Energetik genauer zu beschreiben. Dies ist insofern von Bedeutung, als die Zelltodart ganz wesentlich die Reaktion des Immunsystems und damit die Effizienz der Patientenbehandlung bedingt: Nekrose führt zu inflammatorischen Prozessen, Apoptose bewirkt eine "stille" Entfernung von Zellen, die sogar mit der Produktion wachstumsfördernder Zytokine verbunden ist. Im Rahmen des Projekts konnten folgende interessante Details über die Energetik apoptotischer und nekrotischer Zellen gewonnen werden: 1) PDT mit tetrasulfoniertem Aluminium-(III)-Phthalocyanin (AlPcS 4 ) als Photosensibilisator stellt eine sehr effiziente Methode dar, um in menschlichen A431 Krebszellen Apoptose auszulösen. Man kann bei ansteigenden Behandlungsdosen ein "apoptotisches Fenster" beobachten, welches bei Lichtflußdichten zwischen dem "Überlebensbereich" und dem Bereich des nekrotischen Zelltodes liegt. 2) Apoptotische Zellen sind durch hohe intrazelluläre ATP-Spiegel bis in späte Stadien des aktiven Zelltodes hinein charakterisiert. Bei Nekrosen fällt ATP rasch und vollständig ab. Der zeitliche Verlauft des ATP-Spiegels in Mischpopulationen (überlebende/ apoptotische/ nekrotische Zellen) spiegelt die Zusammensetzung dieser Populationen im Detail wider. 3) In sehr frühen Stadien der Apoptose sinkt das durch die oxidative Phosphorylierung aufgebaute mitochondriale Membranpotential (MMP) - unter normalen Bedingungen Hauptquelle für ATP - rasch, aber nicht vollständig ab. Dies konnte unter Verwendung des potentialsensitiven Fluoreszenzfarbstoffes JC-1 gezeigt werden. Durch den Abfall des MMP wird die ATP-Produktion durch diese Organellen wesentlich verringert. 4) Glukose ist für die Durchführung des apoptotischen Programms nach PDT unbedingt notwendig. Eine Glykolyseinhibition durch Entzug von Glukose induziert Nekrose. Hochregulation der Glykolyse durch die apoptotischen Zellen scheint ein kompensatorischer Effekt zu sein, um ausreichend ATP für den aktiven Zelltod trotz Reduktion der mitochondrialen ATP-Produktion zu erzeugen. Unsere Daten sollten zur Modifikation der klinischen PDT-Protokolle dienen, die - mittlels Manipulation der zellulären Energetik zum Beispiel durch Zugabe oder Entzug von Glukose - ein für die Behandlung optimales Verhältnis von apoptotischen zu nekrotischen Zellen herstellen sollten, welches einerseits Tumore unter starker Beteiligung des Immunsystems entfernt, andererseits aber den Patienten nicht durch massive Inflammation belastet.