NO-Synthase in Physarum polycephalum

Stickstoffmonoxidsynthasen sind eine neu entdeckte Familie von Enzymen, die die Bildung des hochreaktiven Gases Stickstoffmonoxid (NO) aus der Aminosäure L-Arginin katalysieren. Das in dieser Reaktion gebildete NO dient einer Reihe wichtiger Funktionen im Körper, so regelt es zum Beispiel den Blutdruck, eine Entdeckung für die heuer der Nobelpreis für Medizin vergeben wurde. Weitere, von enzymatisch gebildetem NO vermittelte physiologische Effekte sind die Nervenreizleitung, sowie die Abwehr von Infektionen von Viren und Parasiten. Es werden laufend neue Rollen von enzymatisch gebildetem NO entdeckt, so wurde z.B. kürzlich nachgewiesen, daß NO in Pflanzen bei der Abwehr von Pathogenen eine Rolle spielt. NO-Synthasen aus Säugetieren, Insekten und Schnecken wurden bereits molekular charakterisiert. Aminosäuresequenzen von NO-Synthase aus Pflanzen, Bakterien oder Pilzen sind jedoch noch unbekannt. Geleitet von der Tatsache, daß der Schleimpilz Physarum polycephalum Pteridine synthetisiert, die unter anderem von NO-Synthasen als Cofaktoren benötigt werden, untersuchten wir NO-Bildung in diesem Schleimpilz. Wir reinigten und charakterisierten die NO-Synthase aus Physarum und fanden überraschenderweise, daß diese NO- Synthase auffallend dem Enzym ähnelt, das Säugetiere (den Menschen eingeschlossen) zur Abwehr von Krankheitserregern benützen. In der Folge gelang es uns, mit Hilfe der sogenannten Polymerase-Kettenreaktion ein Stück der Nucleinsäuresequenz zu isolieren, das einen Teil des Bauplanes der NO-Synthase des Schleimpilzes Physarum enthält. Ausgehend von diesem Ergebnis wollen wir in dem nun vorliegenden Projekt mit Hilfe molekularbiologischer Techniken die Nucleinsäure isolieren, die den Bauplan der gesamten NO-Synthase von Physarum enthält, und dieses Enzym in Mengen rekombinant herstellen, die die biochemische Charakterisierung und Bildung von Antikörpern gegen das Enzym erlauben. Mit diesen Werkzeugen wollen wir erforschen, wie sich die NO-Bildung in den verschiedenen Stadien des komplexen Lebenszyklus dieses Schleimpilzes verhält. Mit Pharmaka, die in die Bildung oder Wirkung von NO eingreifen, wollen wir dann aufklären, welche Rolle NO für die Entwicklung und den Stoffwechsel dieses Pilzes spielt. Physarum ist ein besonders interessanter Organismus, da er in definierter Weise in verschiedene Entwicklungsstufen geleitet werden kann, und zudem die Zellkerne dieses Organismus sich alle vollkommen gleichzeitig teilen, wodurch die Zellteilung genau studiert werden kann. Wir hoffen, daß die Rolle von NO in Physarum eine neue, noch unentdeckte ist. In diesem Fall wollen wir dann prüfen, ob die in diesem Modellsystem gewonnenen Erfahrungen zu neuen Erkenntnissen auch für menschliche Zellen führen können.

Der Myxomycet Physarum polycephalum, ein Protist, ist ein gut etabliertes Modellsystem zum Studium von Zellzyclus- und Zelldifferenzierungsvorgängen. In unseren Arbeiten konnten wir zeigen, dass dieser Organismus eine kalzium-unabhängige Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) besitzt. Wir haben das Enzym gereinigt, kloniert und vollständig sequenziert. Damit wurde von uns die erste nicht tierische Stickstoffmonoxidsynthase beschrieben. Zur Aufklärung der biologischen Rolle von NO wurden verschiedenste physiologische Vorgänge untersucht. Wir entdeckten, dass die Limitierung von Glucose, eine Voraussetzung für die Sporulation, die NOS Expression stark induziert. Wir identifizierten NO und cGMP als wesentliche Signalmoleküle bei der licht-induzierten Ausbildung reifer Fruchtkörper (Sporangien) und zeigten, dass die Expression von lig1, einem frühen sporulationsspezifischen Gen, das zum Zellzyklus- und DNA-Schaden-Erkennungsgen hus1 aus Hefe und Säugetieren homolog ist, positiv mit der Expression von NOS und der Fähigkeit zu sporulieren korreliert. Dadurch konnte erstmals eine neue biologische Funktion von NO in einem niederen Eukaryonten, die NO/cGMP vermittelte Zelldifferenzierung, beschrieben werden. Im Verlauf dieses Projektes charakterisierten wir weiters zwei Schlüsselenzyme aus dem Pteridinstoffwechsel von Physarum, die GTP Cyclohydrolase I und die Dihydropteridin Reduktase, die für die Bildung von Tetrahydrobiopterin, einem essentiellen Kofaktor der NOS verantwortlich sind. Die Sequenzanalysen zeigten, dass beide Enzyme eine hohe Konservierung zwischen Physarum und dem Menschen aufweisen. Auffallend ist auch, dass die Genstruktur und das alternative mRNA-Spleißen der Physarum GTP Cyclohydrolase I dem menschlichen Enzym sehr ähnlich sind. Mit unserer Arbeit am Protist Physarum konnten wir eine neue Rolle der NO/cGMP vermittelten Zelldifferenzierung beschreiben und es zeigte sich, dass Tetrahydrobiopterin- und NO Biosynthese schon in einem sehr frühen phylogenetischen Entwicklungsstadium etabliert wurden. Die Erkenntnisse aus dem Modellsystem Physarum können dazu beitragen, ein besseres Verständnis der komplexen Signalwege der Zelldifferenzierung zu erlangen, das auch in hoch entwickelten Organismen von Bedeutung sein könnte.