Gentransfer von IL-4, IL-10 und IL-13 bei Peritonitis und Sepsis

Der septische Schock stellt auch heute noch mit einer fünfzig prozentigen Mortalitätsrate eine massive Komplikation bei chirurgischen Patienten dar und verlängert den Aufenthalt auf einer Intensivstation weit über den postoperativen Zeitraum hinaus. Eine Vielzahl von Studien setzte sich die Senkung der während einer Sepsis auftretenden Überproduktion an pro-inflammatorischen Cytokinen, wie z.B. TNF-alpha und Interleukin-1, zum Ziel. Allerdings blieben sowohl der Einsatz von monoclonalen Antikörpern gegen TNF-alpha, die Blockade der Rezeptoren für TNF-alpha und Interleukin-1 als auch die Verabreichung des potenten anti-inflammatorischen Cytokins Interleukin-10 hinter den Erwartungen zurück. Eine systemische Anwendung dieser Inhibitoren der pro- inflammatorischen Cytokine zeigte somit nicht den gewünschten Erfolg, nämlich eine Reduktion dieser Entzündungsmediatoren. Dieses negative Ergebnis ist primär auf die Tatsache zurückzuführen, daß eine systemische Verabreichung der Inhibitoren von pro-inflammatorischen Cytokinen in einer entsprechend hohen Dosierung erfolgen muß, damit es zu einer Neutralisation der erhöhten TNF-alpha Produktion im entsprechenden Kompartiment kommt. Gleichzeitig verhindert diese hohe Dosis jedoch auch die möglicherweise notwendige Produktion pro-inflammatorischer Cytokine in anderen Kompartimenten. Ein Gentransfer erschien uns somit die geeignete Verabreichungsform zur Vermeidung der Nachteile einer systemischen Administration der Inhibitoren von pro-inflammatorischen Cytokinen zu sein. In vorherigen Studien konnten wir zeigen, daß die lokale Applikation der anti-inflammatorischen Cytokine Interleukin-4, Interleukin-10 und Interleukin-13 mittels Liposomen vermitteltem Gentransfer nicht nur die Überlebensrate in einem murinen LPS-Schock Modell signifikant verbesserte, sondern auch die Immunkompetenz der peritonealen Macrophagen wiederherstellte. In all unseren Studien konzentrierten wir uns bisher auf die hyperinflammatorische Phase der Sepsis, den septischen Schock. Wir haben uns jedoch für unsere kommenden Studien die therapeutische wie auch die präventive Behandlung der chronischen Phase der Sepsis zum Ziel gesetzt. Lipopolysaccharid (LPS-) tolerante Tiere bzw. deren LPS-insensitive Zellen dienen uns als Modell für die verminderte Immunabwehr des chronisch, septischen Patienten. Wir glauben, daß die potenten, modulatorischen anti-inflammatorischen Cytokine Interleukin- 4, Interleukin-10 und Interleukin-13 die fehlende TNF-alpha Produktion als Antwort auf zirkulierendes Endotoxin auch in LPS-toleranten Tieren wiederherstellen können. Unser Interesse gilt weiters auch der Behandlung von intra-abdominellen Abszessen und Peritonitis. Die coecale Ligatur und Punktion bietet sich als murines, letales und nicht letales Modell für Peritonitis an. Da wir vom Erfolg einer lokalen, nur einzelne Kompartimente betreffenden Intervention und Behandlung von Peritonitis überzeugt sind, möchten wir die modulatorischen Effekte des Liposomen vermittelten Gentransfers von Interleukin-4, Interleukin-10 und Interleukin-13 in beiden Peritonitis-Modellen hinsichtlich der Überlebensrate und der Immunkompetenz der peritonealen Macrophagen untersuchen. Letztlich wollen wir uns noch mit der Frage beschäftigen, ob der Liposomen vermittelte Gentransfer zu einer Veränderung der nicht-spezifischen Immunantwort und somit möglicherweise zu einer höheren Morbidität bei Infektionen, wie z.B. durch Listeria monocytogenes führt. Wir glauben, daß wir mittels dieser Studien einen weiteren, wichtigen Schritt Richtung einer effizienten, erfolgreichen Behandlung chronisch septischer Patienten erzielen können.

Das klinische Zustandsbild der Sepsis stellt mit einer Mortalitätsrate von 50 Prozent auch heute noch eine massive Komplikation bei Patienten auf Intensivstationen dar. Lipopolysaccharid (LPS) gilt in pathophysiologischer Hinsicht als primärer Auslöser einer gram-negativen, bakteriellen Sepsis und bedingt eine überschießende Produktion pro-inflammatorischer Zytokine wie TNF-a , Interleukin (IL)-1, IL-6, IL-12, aber auch anti- inflammatorischer Mediatoren wie IL-10. Der exakte molekulare Mechanismus, der sich hinter der Aktivierung einer Zelle durch LPS verbirgt, war jedoch lange Zeit ungeklärt. Toll wurde ursprünglich im Rahmen entwicklungsgenetischer Studien in Drosophila entdeckt und erwies sich als essentieller Faktor bei der Determinierung der dorso-ventral Achse im Drosophila Embryo. Neuere Studien konnten jedoch darüberhinaus Mitgliedern der Toll Familie eine wichtige Rolle in der Immunantwort von Drosophila zuschreiben. Verwandte Toll-like Rezeptoren (TLRs) in Mammalia haben ebenfalls große Bedeutung in der Immunabwehr und fungieren als wichtige Vermittler einer unspezifischen Immunantwort. Der Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) in Mammalia konnte erst kürzlich als der lang gesuchte Rezeptor für LPS identifiziert werden. Unsere Studie beschäftigt sich mit der hypoinflammatorischen Phase der Sepsis, die durch das Phänomen der "LPS Toleranz" gekennzeichnet ist. Monozyten von Patienten, die sich in dieser Spätphase der Sepsis befinden, erscheinen refraktär gegenüber weiteren LPS Stimuli und produzieren vermindert TNF-a , IL-1, IL-6, IL-8 und IL- 12 bei neuerlicher Aktivierung mittels LPS ex vivo. Übergeordnetes Ziel dieser Studie war die Überwindung der Paralyse des Immunsystems, um so das stark erhöhte Risiko sekundärer Infektionen in der Spätphase der Sepsis zu minimieren. Wir wählten die Methode des lokalen, Liposomen mediierten Gentransfers der beiden Zytokine IL-10 und IL-13 in einem non-letalen Endotoxemia Modell in der Maus. Balb/C Mäuse wurden durch wiederholte Verabreichung von LPS künstlich in den refraktären Zustand der LPS Toleranz versetzt und anschließend mit hIL-10 bzw. hIL-13 Plasmid-DNA/Liposomen Komplexen transfeziert. Peritoneale Makrophagen der transfezierten Tiere wurden im weiteren Verlauf in vitro mit LPS oder PMA re-stimuliert und die dadurch bedingte Produktion von TNF-a und IL-12 mittels ELISA evaluiert. Unerwartet zeigten unsere Resultate, dass der lokale, Liposomen mediierte Gentransfer von hIL-10 und hIL-13 spezifisch die TNF-a Produktion von Endotoxin refraktären peritonealen Makrophagen nach Re-stimulation mit LPS wiederherzustellen vermag und somit zu einer Aufhebung der LPS Toleranz führt. Dies konnte nicht für die Produktion von IL-12 gezeigt werden. Zum besseren Verständnis der molekularen Abläufe hinter diesem unerwarteten, aber vielversprechenden Ergebnis, war es unser Ziel, die Rolle des LPS Rezeptors TLR4 in der Aufhebung der LPS Toleranz durch Gentransfer von IL-10 und IL-13 in unserem Modell zu untersuchen. Wir begannen daher mit der Produktion eines monoklonalen Antikörpers gegen muTLR4 in der Ratte. Rekombinantes Protein muTLR4, exprimiert in E.coli, war das Antigen der Wahl zur Immunisierung. Die Bildung von "inclusion bodies" machte jedoch eine Reinigung des Proteins selbst unter denaturierenden Bedingungen unmöglich. So verwendeten wir eine transfezierte, syngene Zelllinie, die große Mengen muTLR4 an der Oberfläche exprimierte, als Immunogen. Trotz eines messbaren Serumtiters an spezifischen Antikörpern gegen muTLR4 und mehr als 900 Hybridoma Clonen in den nachfolgenden Fusionen, konnten wir keine spezifischen monoclonalen Antikörper gegen muTLR4 detektieren. Zukünftig werden wir neben zusätzlichen Expressionssystemen wie Hefe und Insektenzellen für rekombiniertes Protein, auch nackte DNA zur Produktion eines monoklonalen Antikörpers gegen muTLR4 verwenden.