PMNL modulierende Faktoren von Patienten mit Nierenversagen

Das hohe Risiko bakterieller Infektionen stellt eine der Hauptursachen für das erhöhte Vorkommen von Morbidität und Mortalität bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CNV) - sowohl unter Hämodialyse- (HD) als auch Peritonealdialyse- (PD) Behandlung - dar. Eine Beeinträchtigung des unspezifischen Immunsystems, vor allem von Polymorphonukleären Leukozyten (PLMN) ist für diese Situation hauptverantwortlich. PMNL sind Zellen der ersten Abwehrlinie der unspezifischen Immunantwort; weiters sind sie die Hauptimmunzellen in der Peritonealhöhle während bakterieller Infektionen. PMNL von urämischen Patienten weisen Störungen in ihren essentiellen Funktionen wie Chemotaxis, Phagozytose und oxidativem Metabolismus auf. Urämietoxine, zirkulierende Plasmafaktoren, die sich im urämischen Plasma anreichern, spielen bei der Inhibierung von PMNL Funktionen eine wesentliche Rolle. In letzter Zeit konnte eine Reihe PMNL inhibierender Faktoren von CNV Patienten isoliert und charakterisiert werden, teilweise durch den Antragsteller. Auch PMNL von Patienten mit akutem Nierenversagen (ANV) weisen Störungen in ihren Funktionen auf und tragen durch ihre erhöhte Aktivierung zu Organschädigungen bei. Die PMNL Aktivierung wird durch überlagerte Sepsis weiter gesteigert. Die Entfernung von PMNL vom Infektionsherd ist wichtig für eine normale Auflösung einer Entzündung und somit für die Kontrolle einer inflammatorischen Gewebeschädigung. Apoptose, eine spezifische Art der Selbstzerstörung von Zellen, erlaubt die Erkennung von intakten alternden PMNI. Ein Hinweis auf die Existenz PMNL modulierender Faktoren in Patienten mit Nierenversagen kommt von Experimenten des Antragstellers. Es konnte gezeigt werden, daß gebrauchte PD Lösungen sowie Ultrafiltrate von CNV Patienten unter HD Behandlung und von ANV Patienten die spontane Apoptose von PMNL gesunder Spender inhibieren können und daß Faktoren, von denen gezeigt wurde, daß sie essentielle PMNL Funktionen inhibieren (freie Immunoglobulin Leichtketten), die PMNL Apoptose konzentrationsabhängig hemmen. Das Hauptziel dieser Studie ist, weitere PMNL modulierende Faktoren aus Patienten mit Nierenversagen zu isolieren und zu charakterisieren. Für die erste Serie von Experimenten ist geplant, folgendes Ausgangsmaterial zu verwenden: a) eine gebrauchte PD Flüssigkeit; b) ein Ultrafiltrat eines HD Patienten; c) ein Ultrafiltrat eines ANV Patienten ohne Sepsis; d) ein Ultrafiltrat eines ANV Patienten mit Sepsis. Folgende Trennmethoden sollen verwendet werden: 1) lonenaustausch-Chromatographie; 2) Gelfiltration; 3) "Reversed Phase"-Chomatographie; 4) Chromatofokussierung. Als erster Trennschritt soll Anionenaustausch- Chromatographie verwendet werden. Verschiedene Protein Peaks, die voraussichtlich noch ein Proteingemisch enthalten, werden erhalten werden. Die biologische Aktivität eines jeden Peaks soll getestet werden. Folgende Funktionstests werden eingesetzt werden, um den Effekt der Proteine auf PMNL gesunder Spender zu testen: Chemotaxis, Hexoseaufnahme, oxidativer Metabolismus, Phagozytose und intrazelluläre Keimabtötung, intrazelluläres Calcium sowie die Modulation der spontanen Apoptose (charakteristische DNA Strangbrüche, Änderungen in Morphologie, Membranassymetrie und der Aktivität von Proteasen). Aktive Peaks werden molekular charakterisiert werden: Mittels Gelelektrophorese wird das Molekulargewicht und mittels isoelektrischer Fokussierung der isoelektrische Punkt der Proteine in den einzelnen Peaks bestimmt. Basierend auf den erhaltenen Resultaten wird individuell bestimmt werden, welche Trennmethode als nächstes für jeden Satz von Proteinen verwendet werden wird. Durch aufeinanderfolgende Auftrennungen der aktiven Peaks wird ein Satz von gereinigten Proteinen erhalten werden. Jedes Protein wird eine oder mehrere essentielle PMNL Funktionen und/oder PMNL Apoptose modulieren. Um zu zeigen, daß die erhaltenen Ergebnisse repräsentativ für die jeweilige Patientengruppe sind, sollen insgesamt sechs Isolationen pro Gruppe durchgeführt werden. Die Isolierung und Charakterisierung PMNL modulierender Faktoren sind für künftige Diagnose und Therapie von Bedeutung. Dieses Projekt wird zur Identifizierung neuer PMNL beeinflussender Proteinfaktoren führen. Dies wird die Basis für weitere Forschung sein: Studien über den Wirkmechanismus der identifizierten Faktoren, Entwicklung von Tests zur Konzentrationsbestimmung der Faktoren in Seren von Patienten mit Nierenversagen sowie Untersuchungen zur selektiven Entfernung der identifizierten Urämietoxine aus den Seren dieser Patientengruppen.

Aus Personen mit Nierenversagen wurden Faktoren isoliert und charakterisiert, die zu deren gestörter Immunfunktion beitragen. Die Kenntnis dieser Substanzen ist Voraussetzung zur gezielten Behandlung dieser Patienten. Urämische Patienten, d.h. Patienten mit verminderter Nierenfunktion, haben ein erhöhtes Risiko von bakteriellen Infektionen und von Herz- und Gefäßerkrankungen und in der Folge eine erhöhte Erkrankungs- und Sterblichkeitsrate. Eine wesentliche Ursache dafür ist die Störung wichtiger Funktionen von PMNL, Zellen der unspezifischen Immunabwehr. Urämietoxine spielen eine Hauptrolle bei der Hemmung von PMNL Funktionen. Dies sind zirkulierende Plasmafaktoren, die sich im Serum urämischer Patienten als Folge verminderter Ausscheidung anreichern. Die Reinigung und Charakterisierung von Urämietoxinen sind Voraussetzung für künftige Anwendungen in Diagnose und Therapie wie etwa die gezielte Entfernung von Urämietoxinen von Patienten mit Nierenversagen. Es war daher Ziel dieses Projekts, neue PMNL beeinflussende Faktoren von urämischen Patienten zu identifizieren. Bisher gibt es keine Berichte über PMNL beeinflussende Faktoren bei Patienten mit akutem Nierenversagen, deren Immunfunktion ebenfalls gestört ist. Daher waren Urämietoxine von dieser Patientengruppe ein Hauptaugenmerk dieses Projekts. In den letzten Jahren wurde die Bedeutung des programmierten Zelltodes ("Apoptose") von PMNL für die Auflösung von Entzündungen und für die Veränderung von PMNL- Funktionen erkannt. Folglich wurde auch die Apoptose von PMNL in diesem Projekt untersucht. Aus den Ultrafiltraten, die während der Hämodialysebehandlungen von Patienten mit Nierenversagen gewonnen wurden, wurden Proteine gereinigt und ihre Effekte auf PMNL Funktionen getestet. Im wesentlichen wurden drei Gruppen von Proteinen, die PMNL Funktionen verändern, aus Ultrafiltraten von Patienten mit akutem Nierenversagen gereinigt und charakterisiert: Freie leichte Ketten von Immunglobulinen, modifizierte Formen von ß2-Mikroglobulin und Retinol bindendes Protein (RBP). Während Effekte von freien leichten Ketten von Immunglobulinen und modifizierte Formen von ß2-Mikroglobulin, die von Patienten mit chronischem Nierenversagen isoliert wurden, auf PMNL Funktionen bereites beschrieben wurden, gibt es noch keine Berichte zu dem Einfluss von RBP auf PMNL. Bei RBP handelt es sich um ein Protein, das Vitamin A (Retinol) von der Leber zu peripheren Organen transportiert. Wir konnten zeigen, dass isoliertes RBP die gerichtete Bewegung (Chemotaxis), die Aufnahme von Bakterien (Phagozytose) und die Produktion von reaktivem Sauerstoff (der für die Keimabtötung verwendet wird) durch PMNL hemmt. Weiters erhöht RBP die Geschwindigkeit des apoptotischen Zelltodes. Die Untersuchung von weiteren RBP Präparationen und von käuflich erwerblichem RBP zeigte, dass die Effekte von RBP teilweise von seinem Gehalt an Vitamin A abhängen. Diese Arbeit beschreibt erstmalig den Einfluss von RBP auf PMNL Funktionen. Wir beschreiben damit auch zum ersten Mal die Reinigung eines PMNL beeinflussenden Proteins aus dem Ultrafiltrat von ARF Patienten.