Beschleunigte Entwicklung zielgerichteter Arzneiformen mittels Echtzeit-Verfolgung der Ligand/Rezeptor-Wechselwirkung

Die Entwicklung neuer Arzneistoffe zur Behandlung von z.B. Krebs oder Infektionskrankheiten wie HIV gehört zu den größten Herausforderungen der medizinischen Wissenschaften. Immer öfter beruht das Design der Arzneistoffe auf Kenntnissen über spezielle molekulare Wechselwirkungen z.B. der Reaktion eines Hormons mit seinem in der Zellmembran verankerten Rezeptor. Auf dieser molekularen Basis geplante und produzierte Arzneistoffe müssen hinsichtlich ihrer Aktivität in vitro Tests überprüft werden. Häufig dienen sogenannte "screening assays" zur Erstellung einer ersten "Rangliste" der möglichen Kandidaten, indem jene Arzneistoffe, die innerhalb des gewählten Assay-Aufbaus nur geringe Aktivität zeigen, ausgeschieden werden. Da dieser Forschungsbereich besonders kostenintensiv ist, sind Methoden, welche die Arzneistoff-Entwicklung einerseits durch eine Verkürzung der Assaydauer und andererseits durch eine Verbesserung der Aussage der Assays verkürzen von besonderem Interesse. Aus diesem Grund sind Methoden, welche eine Verfolgung von Bindungskinetiken biorekognitiver Prozesse in Echtzeit ermöglichen, konventionellen Endpunkt Tests (z.B. ELISA) überlegen: verläßlichere Daten als bei Ein-Punkt Messung kurze Meßzeiten keine Probenvorbereitung Verfolgung sehr schneller Reaktionen möglich größerer Informationsgehalt kinetischer Messungen (z.B. Affinitäten) Surface Plasmon Resonance ist die zur Zeit am weitesten verbreitete Technik zur Verfolgung von Bindungskinetiken. Obwohl diese Methode den unzweifelhaften Vorteil besitzt, daß keine Markierung der zu untersuchenden Komponenten benötigt wird, wird ihre Anwendbarkeit oft durch die sehr hohen Kosten des benötigten apparativen Aufbaus eingeschränkt. In diesem Projekt soll die Anwendbarkeit einer einfachen und kostengünstigen auf Fluoreszenzverstärkung beruhenden Technik zur Echtzeit-Verfolgung von biomolekularen Wechselwirkungen demonstriert werden. An Mikrotiterplatten gebundene Silber Kolloide verstärken die Fluoreszenz von Molekülen in ihrer Nähe, wodurch die Unterscheidung zwischen oberflächengebundenen und in Lösung befindlichen Molekülen in einer Ein-Schritt Reaktion ohne Waschschritte möglich wird. Diese Technik ist kompatibel zum Mikrotiterplatten Format und verwendet handelsübliche Fluoreszenz-Mikrotiterplatten Reader als Meßgerät. Unter Verwendung der beschriebenen Technik konnten wir bereits mit ELISA Techniken vergleichbare Detektiongrenzen bei einer Meßdauer von unter 10 Minuten erreichen. Ziel des Projektes ist es das beschriebene Assaydesign zur beschleunigten Entwicklung von Arzneistoffen in der Krebsforschung zu verwenden. Bei der zu untersuchenden Stoffklasse handelt es sich um sogenannte zielgerichtete Arzneiformen, welche über eine spezifische Wechselwirkung gezielt an pathologische Zellen binden und somit die Vermeidung unerwünschter Nebenwirkungen ermöglichen. Im allgemeinen bestehen derartige Arzneistoffe aus einem Biomolekül, das die zelluläre Spezifität garantiert (z.B. ein Antikörper) und einer zytotoxischen Komponente. Da hinsichtlich des Wirkungsmechanismus derartiger Arzneiformen zwei Gruppen zu unterscheiden sind - Stoffe, die durch Aufnahme in die Zelle wirken und solche, deren Wirkung auf ihrer Bindung an einen Oberflächenrezeptor beruht - sollen beide Gruppen unter Echtzeit Verfolgung der Bindungskinetik mittels der beschriebenen Technik zur Fluoreszenzverstärkung an Kolloiden untersucht werden: a) Gegen Colon-Karzinome gerichtete Lektin-Doxorubicin Konjugate (Endozytose abhängig). Zielsetzung: Unterscheidung zwischen Einfluß der Bindungskinetik und des Transportes des Arzneistoffes durch die Zellschicht b) Gegen Brustkrebs gerichtetes Tumornekrosefakter-Immunotoxin (nicht Endozytose abhängig). Zielsetzung: Kovalente Kopplung von TNF und spezifischen Antikörper mit unterschiedlichen Spacer-Längen mit besonderer Berücksichtigung der zur Bindung an die Zelle notwendigen Beweglichkeit des TNF im Konjugat. Die Untersuchung der verschiedenen Arzneistoffe erfolgt mittels eines kompetitiven Assay-Aufbaus, um die Fluoreszenzmarkierung jedes einzelnen Arzneistoffes zu vermeiden. Zwei verschiedene Test-Oberflächen sollen zur Bestimmung der Affinitäten der zielgerichteten Arzneiformen hergestellt werden: direkt an die mit Kolloid beschichteten Oberflächen adsorbierte Rezeptoren und künstliche Tumorzelloberflächen. Diese "lebensechten" Oberflächen sollen durch die Fusion von Zellmembranvesikeln mit an die Kolloidoberfläche gebundenen "self assembled monolayers" (SAMs) hergestellt werden.

Nanopartikel aus Silber verstärken die Fluoreszenz nur von jenen Molekülen, die sich in der Nähe ihrer Oberfläche befinden. Die Nutzung dieses Phänomens im high throughput screening erspart einen zusätzlichen Arbeitsschritt und ermöglicht die Erfassung von Wechselwirkungen in Echtzeit. Einerseits erlaubt die Beschichtung der Nanopartikeloberfläche mit Antikörpern oder isolierten Rezeptoren die Charakterisierung und die Identifikation von Leitsubstanzen. Andererseits bieten biomimetische Oberflächen wie Mucin-Schichten oder künstliche Zellmembranen rasche Informationen über biorekognitive Prozesse direkt an der Resorptionsbarriere des Arzneistoffes. Im Vergleich zu teuren, im Handel erhältlichen Meßsystemen stellt die Silbernanopartikel verstärkte Fluoreszenz-Technik eine einfache und billige Alternative zur Charakterisierung von biologischen Wechselwirkungen dar und kann möglicherweise zur Reduktion der in Arzneistoffforschung und -Entwicklung nötigen Tierversuche beitragen. Aus Kostengründen gewinnen derzeit Methoden zur beschleunigten Entwicklung von Wirkstoffen immer mehr an Bedeutung. Immer häufiger basieren neue Wirkstoffe auf der Kenntnis spezifischer Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Liganden. Trotzdem muß die biologische Aktivität in zeitaufwändigen in-vitro und in-vivo Tests untersucht werden. Bereits in diesem frühen Entwicklungsstadium von Wirkstoffen ermöglicht die Echtzeitverfolgung von biologischen Wechselwirkungen die Identifikation von Leitsubstanzen und den Ausschluß wenig effizienter Wirkstoffe. Die Silbernanopartikel verstärkte Fluoreszenz-Technik wird als Alternative zur surface plasmon resonance-Technik vorgestellt. Nanopartikel aus Silber verstärken die Strahlung von fluoreszierenden Molekülen in einem Bereich von etwa 5-50nm oberhalb ihrer Oberfläche. Um diese Fluoreszenzverstärkung zur Erfassung biorekognitiver Wechselwirkungen nützen zu können, wurde die Nanopartikeloberfläche mit verschiedenen Liganden modifiziert: Die Adsorption von Antikörpern über eine Zwischenschicht führt zu einer Applikation im Bereich Immunoassays. Da biologisch aktive Proteine nicht fluoreszieren, wird an Hand von Insulin ein kompetitiver Test vorgestellt, der in einer Einschrittreaktion einen Arbeitsbereich von 10-200nM Insulin in Serum umfasst. Obwohl Rezeptor-Ligand Wechselwirkungen üblicherweise erst durch radioaktive Markierung meßbar werden, ist das Detektionslimit bei Einsatz von Silbernanopartikel-gebundenen Rezeptoren und fluoreszierenden Liganden ausreichend. Am Beispiel von Weizenlektin, des zielerkennenden Elementes in Lektin-hältigen Arzneiformen, wird die mittlere Bindungsgeschwindigkeit, die Affinität und Spezifität der Wechselwirkung mit intaktem epidermalem Wachstumsfaktor gezeigt. Nicht nur Kenngrößen für Wirkstoffe, sondern auch biopharmazeutisch relevante Parameter können durch diese Technik erfasst werden. Durch Beschichtung mit artifiziellen Zellmembranen aus Tumorzellen oder aus Modellzellen für den Dünndarm ergibt sich ein Testsystem, das die Beobachtung von Ereignissen direkt an der Zelloberfläche ermöglicht. Nicht nur die Zellmembran von Enterozyten, sondern auch die aufgelagerte Mucusschicht behindert die Resorption von Wirkstoffen. Auch durch Experimente mit Mucin-beschichteten Silbernanopartikeln konnte der Anwendungsbereich auf die Entwicklung von Formulierungen ausgedehnt werden. Insgesamt ermöglicht die Silbernanopartikel verstärkte Fluoreszenz-Technik die Verfolgung von biologischen Wechselwirkungen in Echtzeit bei einem ELISA-Techniken vergleichbaren Detektionslimit. Durch die Durchführung der Tests als Einschrittreaktion und durch die Kompatibilität mit dem gebräuchlichen Mikrotiterplattenformat ist diese Technik insbesondere für das high throughput screening geeignet.