Lokalisierung von Hefe-Proteinkinase A und Msn2

Einzellige Mikroorganismen wie die Sproßhefe Saccharomyces cerevisiae leben in freier Natur in einer Umgebung, die sich oft und schnell verändert. Davon sind insbesondere Qualität und Quantität des Nährstoffangebots und eine größere Zahl anderer Faktoren betroffen, die für das Zellwachstum günstig oder ungünstig sind. Unter solchen Bedingungen besitzen Einzeller mit der Fähigkeit, sich rasch an plötzliche Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen, einen beachtlichen Selektionsvorteil und damit das Potential, sich gegen Konkurrenten durchzusetzen. Es ist daher nicht überraschend, daß offenbar alle heute in der Natur lebenden Einzeller molekulare Mechanismen entwickelt haben, die ihnen entsprechende Fähigkeiten verleihen. Solche Mechanismen sind auch, der speziellen Situation der jeweiligen Zelltypen angepaßt, in den verschiedenen differenzierten Zellen der komplexeren vielzelligen Organismen vorhanden. Wir und andere Forschergruppen haben die Sproßhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus verwendet, um Faktoren zu studieren, die die Reaktionen von Zellen auf ihre Umgebung steuern. Dabei wurde gezeigt, daß die durch zyklisches Adenosinmonophosphat aktivierte Proteinkinase A von S. cerevisiae eine Schlüsselrolle im Rahmen von effizienten zellulären Reaktionen auf günstige und ungünstige Wachstumsbedingungen besitzt. Das vorliegende Projekt stellt einen Versuch dar, auf der Basis unserer eigenen Erkenntnisse über die Funktionsweise von Hefe-Proteinkinase A die molekularen Details und die an den Reaktionen von Hefezellen zusammen mit Proteinkinase A beteiligten Faktoren näher zu studieren. Dadurch hoffen wir besser zu verstehen, wie sich Hefezellen erfolgreich ihrer sich rasch verändernden natürlichen Umgebung anpassen können. Diese Untersuchungen sollten indirekt auch zum Verständnis der Mechanismen der Anpassung höherer Organismen beitragen. Wir konnten vor kurzem zeigen, daß eine die Aktivität von Proteinkinase A regelnde Untereinheit unter Bedingungen, die das Zellwachstum begünstigen, im Zellkern lokalisiert ist, und daß diese Lokalisierung das Wachstum von Hefezellen begünstigt, wenn diese nach dem Auftreten von Nährstoffmangelbedingungen wieder in eine Wachstumsphase eintreten können. Die in diesem Zusammenhang eine Rolle spielenden molekularen Mechanismen sollen im Rahmen des hier vorliegenden Projekts naher studiert werden. Weiters haben wir in der Vergangenheit zeigen können, daß Hefe-Proteinkinase A eine Überreaktion von Hefezellen auf äußere Streßfaktoren verhindert, insbesondere dadurch, daß sie dem streßinduzierten Transport des Mm2-Proteins, eines durch Streß aktivierten Transkriptionsfaktors, in den Zellkern entgegenwirkt. In diesem Zusammenhang wollen wir im vorliegenden Projekt untersuchen, ob Proteinkinase A mit Mm2 direkt in Wechselwirkung tritt, oder ob die beobachtete Steuerung des Mm2-Transports mehr indirekt erfolgt. Jedenfalls sollen die molekularen Mechanismen der Regulation des Kernimports und Kernexports von Mm2 durch Proteinkinase A naher untersucht und dadurch allgemein zum Verständnis der Mechanismen solcher Prozesse beigetragen werden.

Hefezellen müssen Informationen über Nahrungsquellen und physische Stressbedingungen erfassen und prozessieren um sich auf eine bestimmte Überlebensstrategie festzulegen. Diese Umweltparameter bestimmen ob mehr Enegie in Wachstum und Proliferation oder Schutz gegen Umwelt induzierte Schäden und Reparatur investiert wird. Das Proteinkinase A System spielt bei dieser Entscheidung eine entscheidende Rolle. So wird vor allem die Expression eines großen Teils der genomischen Information wesentlich von der Aktivität dieser Kinase beeinflußt. Unter anderem wird bei hoher PKA kinase Aktivität die Aktivierbarkeit vieler Stress induzierter Gene herabgesetzt. Zustände mit niedriger PKA Aktivität erlauben jedoch eine relativ schnelle und hohe Expressionsrate dieser Gene. Während logarithmischen Wachstums auf Glucose scheint ein Paar von redundanten Transkriptionsfaktoren das Hauptziel der Kinase zu sein. Diese zwei Faktoren aus der Familie der Zinkfingerproteine, Msn2 und Msn4 sind die wichtigsten Faktoren in der Aktivierung von Stressgenen unter einer Vielzahl zellschädigender Bedingungen. Msn2 und Msn4 verhalten sich dabei wie Integratoren von verschiedenen Umweltbedingungen. Was die mechanistische Grundlage der Integrationsschritte ist war eine Fragestellung dieses Projekts. Darüberhinaus waren wir daran interessiert neue Möglichkeiten zur Bestimmung der Proteinkinase A zu finden, wobei Methoden, die einen direkten Schluß auf die in vivo Aktivität zuließen, im Vordergrund lagen. Wir erwarteten davon, mehr über die eigentlichen Umweltbedingungen und Signalsysteme zu erfahren, die die Aktivität dieser für Hefe so wichtigen Kinase beeinfussen. Einer der Hauptpunkte war es die intrazelluläre Verteilung der verschiedenen Akteure zu bestimmen, was prinzipiell über die Verfolgung von GFP-Fusionen mittels mikroskopischer Methoden erreicht wurde. Die untersuchten Proteine waren die inhibitorisch wirkende regulatorische Untereinheit der PKA, Bcy1, die katalytisch aktive Untereinheit Tpk1 und der Trankriptionsfaktor Msn2. In Bezug auf die Lokalisierung der Proteinkinase A konnten wir zeigen, daß Bcy1 hauptsächlich im Kern zu finden ist, während Tpk1 ein mehr verteiltes Muster zeigt. Unter cAMP defizienten Bedingungen wird die katalytische Untereinheit jedoch auch im Zellkern konzentriert. Bcy1 sebst zeigt nur unter langzeitigem Wachstum auf schlecht verwertbaren Kohlenstoffquellen eine Umverteilung zum Zytoplasma. Ein Projektteil befaßte sich mit der Suche nach zytoplasmatischen Verankerungen, die diese Umverteilung steuern könnten. Ein Kandidat wurde identifiziert. Jedoch zeigte sich, daß auf Grund der komplexen Wachstumbedingungen eine einfache Interpretation weiterer Analysen nicht leicht erreichbar war. Weitere Studien befassten sich hauptsächlich mit dem Problem wie PKA die Funktion von Msn2 steuert. Dabei ergab sich, daß die Kinase Msn2 auf mehreren funktionellen Ebenen kontrolliert. Sie erniedrigt die nukleare Importrate, erhöht die nukleare Exportrate und blockiert die Bindung von Msn2 an die DNA. Über Analysen der Kernimportsignale konnten wir zeigen, daß die meisten Stresssituationen nicht indirekt über PKA weitervermittelt werden. Der einzige Umweltparamter, der unter akuten Bedingngen diese Kinase moduliert ist Glucose. Allgemeiner Stress scheint auf Regulation des Kernexports und der DNA Bindung zu zielen, indem PKA Modifikationen entfernt oder blockiert werden. Weiters konstruierten wir ein hyperaktives Allel von Msn2, indem wir speziell potentielle Modifizierungsstellen in der DNA Bindungsdomäne mutierten. Da die Expression dieses Allels Wachstum und Proliferation der Hefe stark beeinflussen, konnten wir damit sie einen neuen Zugang zum weiteren Studium der Wachstumsregulation in Hefe etablieren.