Multidimensionale Analyse der Metalloproteine im Blut

Die essentiellen Spurenelemente spielen eine wesentliche Rolle im menschlichen Metabolismus. Cu, Zn, Mn und Se sind Bestandteile der antioxidativen Enzyme (Superoxidasen, Glutathionperoxidase). Verschiedene Spezies der Elemente Fe und Cu und andere Spurenelemente wie Cr beeinflussen das Gleichgewicht zwischen antioxidativen und pro-oxidativen Stoffen im Blut. Deshalb müssen analytische Methoden zur Bestimmung der Elementspezies ausgearbeitet werden. Für die Trennung von Metallproteinkomplexen werden Kombinationen von chromatographischen Techniken, die auf den unterschiedlichen Trennprinzipien beruhen (Hydrophob Interaction, HIC, Size Exclusion, SEC, Ion Exchange, IEC, oder Affinitätschromatographie, Affichro), sowie auch elektrophoretische Trenntechniken wie zweidimensdionale Polyacrylamid - Gelelektrophorese (2-D PAGE), Kapillar-Zonenelektrophorese (CZE) und Isotachophorese (ITP) verwendet. Die elementspezifische atomspektrometrische Detektion mittels induktiv gekoppelter Plasma- Atomemissionsspektrometrie (ICP-AES) oder Graphitrohr-Atomabsorptionsspektrometrie (GFAAS) bzw. die massen- und fragmentselektive massenspektrometrische Detektion (MS-MS) sollen on-line oder off-line mit den verschiedenen Trennmethoden gekoppelt werden, und die analytischen Möglichkeiten der resultierenden gekoppelten Techniken sollen im bezug auf ihre Tauglichkeit zur Lösung der Problemstellung verglichen werden. Ziel dieser Studie ist die Entwicklung und Selektion einer optimalen Kombination von Trennmethoden mit der elementspezifischen Detektion der Metallspezies und Metallkomplexe. Dabei sollte eine möglichst genaue Information für die Charakterisierung dieser Spezies erhalten werden. Mit der ausgewählten Kombination von Methoden soll sowohl der Status dieser Elemente im Blut, als auch die Verteilung ihrer Spezies in Blutfraktionen untersucht werden.

Die Untersuchung des Stoffwechsels von Spurenelementen und Antioxidantien im menschlichen Blut und in Blutfraktionen (Erythrozyten, Plasma, Lymphozyten) kann neue Erkenntnisse über chronische Krankheiten (z.B. Diabetes mellitus, Parkinson Syndrome oder Alzheimer Krankheit) liefern. Die essentiellen Spurenelemente Cu und Zn sind Bestandteile von antioxidativen Enzymen (Superoxiddismutasen), die beim Stoffwechsel der freien Sauerstoffradikale eine Rolle spielen. Der Status dieser Elemente im Blut, sowie die Verteilung ihrer Spezies in Blutfraktionen wurde untersucht. Es konnten die Elemente Zn und Cu der SOD sowohl in den Erythrozyten als auch im Blutplasma eindeutig zugeordnet werden, wodurch die Bestimmung der SOD über die Elementdetektion ohne eine vollständig durchgeführte und damit aufwendigere Proteintrennung ermöglicht wird. Für die Trennung der metallhaltigen Proteine wurden chromatographische Techniken, die auf unterschiedlichen Trennprinzipien ( hydrophobe Wechselwirkung, Molekülgröße) beruhen, angewendet. Weiters kamen Gelelektrophorese und Kapillarelektrophorese zur Anwendung. Für die Bestimmung der beteiligten Spurenelemente bieten sich atomspektrometrische Methoden (ICP-AES und GFAAS) an, die eine elementspezifische Detektion bis in den Ultraspurenbereich der Metalle ermöglichen. Die Endbestimmungen wurden für jede Trennmethode gesondert entsprechend optimiert, da unterschiedliche und zum Teil nur äußerst geringe Probenmengen untersucht wurden. Die in verschiedener chemischer Umgebung (Matrix) vorliegenden Analyten erschwerten darüberhinaus eine exakte Metallbestimmung. Für die medizinische Diagnostik ist es interessant, eine routinemäßig durchführbare Kopplung der Trenn- mit den Detektionsmethoden auszuarbeiten. Die nach den chromatographischen Trennungen mit ICP-AES gemessenen Profile zeigen, daß sich die Hauptmengen der Elemente Cu, Fe und Mn jeweils in verschiedenen Fraktionen befinden. Zn und Cu konnten sowohl in den Erythrozyten als auch im Blutplasma der SOD (Superoxiddismutasen) eindeutig zugeordnet werden, wodurch die Bestimmung der SOD über die Elementdetektion ohne eine vollständig durchgeführte und damit aufwendigere Proteintrennung ermöglicht wird. Daraus kann man schließen, daß die Proteine, die diese Elemente enthalten, durch die HIC Methode getrennt werden können. Auch das Tentakel SEC System wurde für die Trennung von Proteinen in echten Proben verwendet. Eine off-line Detektion von Cu, Fe, Zn, und Mn konnte zu einer Identifizierung der Cu/Zn-SOD in den Erythrozyten herangezogen werden, während die off-line Kopplung für die Fe Bestimmung nach Trennung des Hämoglobins in den Erythrozyten erfolgreich durchgeführt werden konnte. Der Nachteil dieser Methode besteht in der dabei auftretenden starken Verdünnung der Probe. Die entwickelte Methode ist für eine Identifizierung der Metall-Proteinkomplexe, aber noch nicht für ihre quantitative Bestimmung geeignet. Da sich alle diese Trenntechniken durch verschiedene Vorteile auszeichnen, können sie für die Aufklärung verschiedener Vorgänge eingesetzt werden. Die unterschiedlichen Konzentrationsbereiche der Metalle können durch die Anwendung von zwei verschiedenen atomspektrometrischen Methoden erfaßt werden. Aus der Summe der Ergebnisse kann dann ein umfassendes Gesamtbild der Abläufe in den biologischen Systemen entwickelt werden.