Strukturelle Organisation des Zellkerns durch LAP2-Alpha

In den meisten eukaryontischen Zellen zerfällt der Zellkern während der Zellteilung und wird in den Tochterzellen wieder aufgebaut. Die strukturelle Organisation des Zellkernes und des Chromatins sind wesentlich an der Regulation der Genexpression beteiligt, aber die molekularen Mechanismen sowie die dafür wichtigen Kernproteine sind noch weitgehend unbekannt. Die Kernlamina, ein filamentöses Proteinnetzwerk der Kernhülle, das direkt unter der Kernmembran liegt, sowie integrale Membranproteine der inneren Kernmembran, die fest an der Lamina verankert sind, könnten sowohl bei der Kernstrukturierung in der Interphase als auch bei der Zellzyklus-abhängigen Umstrukturierung des Kernes eine wesentliche Rolle spielen. Lamina-assoziiertes Polypeptid 2b (LAP2b ) ist eines dieser Membranproteine, dem auf Grund von früheren Bindungs- und Lokalisationsstudien eine solche Rolle zugeschrieben wird. Erst kürzlich wurden mehrere verwandte Proteine identifiziert, die zusammen mit LAP2b alle aus einem Gen durch alternatives Spleißen entstehen. Die meisten dieser Proteine sind strukturell sehr ähnlich zu LAP2b , wobei nur kleine Abschnitte im Protein entfernt werden. Das größte Mitglied der LAP2 Proteinfamilie, LAP2a , ist mit den andern LAP2 Proteinen nur im amino- terminalen Drittel der Polypeptidkette identisch, während die restlichen zwei Drittel eine völlig unabhängige Sequenz und Struktur aufweisen. Wir haben kürzlich gezeigt, daß LAP2a ein Kernstrukturprotein darstellt, und daß es wahrscheinlich beim Wiederaufbau des Kerns nach der Zellteilung eine wesentliche Rolle spielt (Dechat et al., EMBO J. in press) In dem vorgeschlagenen Projekt wollen wir nun die Interaktionen dieses Proteins im Verlaufe des Zellzyklus im Detail analysieren, sowie mögliche Funktionen des Proteins aufklären. Die geplanten Ansätze sind: (1) Identifizierung der Bindungspartner von LAP2a im Kern: Bisher haben wir gezeigt, daß das Protein sehr früh im Verlauf der Kernbildung an Chromosomen bindet; die direkten Interaktionspartner sind aber noch nicht bekannt. Wir planen mit Hilfe des Hefe "Two hybrid"-Systems, sowie mit verschiedenen in vitro Bindungsstudien diese Bindungspartner zu identifizieren. (2) Lokalisation funktioneller Domänen im LAP2a Molekül: Um funktionelle Bindungsdomänen im LAP2a zu identifizieren, werden wir mit molekularbiologischen Methoden verschiedene LAP2a Domänen in Bakterien exprimieren, reinigen, und für in vitro Bindungsstudien mit Chromosomen, Laminen und neu identifizierten Bindungspartnern einsetzten. Parallel dazu planen wir, diese Proteindomänen induzierbar in tierischen Gewebekulturzellen zu exprimieren und deren zelluläre Lokalisation mit Hilfe der Laser- und der Elektronenmikroskopie, sowie deren Interaktionen in Immunopräzipitationsstudien zu untersuchen. (3) Charakterisierung der Zellzyklus-abhängigen Phosphorylierung des Proteins: In den früheren Studien haben wir eine Korrelation der Phosphorylierung von LAP2a mit dessen Umlagerung festgestellt. Es soll nun geklärt werden, ob die Phosphorylierung von LAP2a direkt die Funktionen und die Wechselwirkungen des Proteins regulieren kann. Wir werden mit Hilfe von in vitro und in vivo Phosphorylierungsanalysen die Phosphorylierungsstellen im Protein in verschiedenen Zellzyklusstadien identifizieren, die dafür verantwortlichen Proteinkinasen charakterisieren, und den Effekt der Phosphorylierung auf die in vitro Bindungen von LAP2a untersuchen. (4) Aufklärung der Funktionen des Proteins beim Kernaufbau: Unter Verwendung eines zellfreien Systems zur Analyse des Kernaufbaus wollen wir den Einfluß von Antikörpern gegen LAP2a sowie von mutierten rekombinanten LAP2a Proteinen auf den Kernaufbau testen. Weiters planen wir mutierte LAP2a Proteine zu bestimmten Zellzyklusstadien in Gewebekulturzellen zu exprimieren und den Einfluß dieser Mutanten auf den Kernaufbau sowie auf die Zellproliferation in vivo zu untersuchen.

Im Rahmen dieses Projektes haben wir die dynamischen Interaktionen und Funktionen des Kernstrukturproteins Lamina-assoziiertes Polypeptid 2 (LAP2) alpha untersucht. Diese Studien zeigten, dass das Protein eine Rolle in der Chromosomenorganisation, in der Zellteilung und in der Zellproliferation besitzt. Diese Resultate lieferten äußerst interessante Hinweise über eine mögliche Verbindung des Proteins zu humanen Erbkrankheiten, die klinisch durch Degeneration des Muskel-, Fett- und Nervengewebes charakterisiert sind, deren molekulare Ursachen aber noch völlig ungeklärt sind. Zellkerne in Säugetieren sind komplexe Organellen, deren Funktionen wesentlich von der räumlichen Organisation des Chromatins abhängen. Die Kernlamina an der Kernhülle, Lamin-komplexe im Kerninneren und Lamin- assoziierte Proteine sind wesentlich an der strukturellen Organisation beteiligt. Man vermutet, dass die Verankerung des Chromatins an der Kernhülle die Genexpression während der Zelldifferenzierung kontrollieren kann. Während der Zellteilung in multizellulären Eukaryonten wird der Kern komplett abgebaut, und nach der Trennung der Schwesterchromatiden werden zwei Tochterkerne neu gebildet. Dieser Prozess wird durch die zeitlich regulierte Interaktion von Strukturproteinen mit Chromatin möglich, die dafür verantwortlichen molekularen Mechanismen sind aber noch weitgehend unbekannt. Unsere Forschungsaktivitäten konzentrierten sich auf Isoformen des Lamina-assoziierten Polypeptides 2 (LAP2), welche sowohl in der Kernmembran (LAP2beta) als auch im Kernskelett (LAP2alpha) vorkommen. Beide Proteine binden Chromatin in der Interphase, dissoziieren aber während der Zellteilung in das Cytoplasma. LAP2alpha lagert sich bereits wieder in sehr frühen Stadien des Kernaufbaues an die Chromosomen an und ermöglicht wahrscheinlich deren geordnete Dekondensation, während LAP2beta in späteren Stadien die Kernmembran- und Kernlaminabildung induziert. Aufgrund dieser Daten schlagen wir ein molekulares Model für den post-mitotischen Kernaufbau vor, in dem die koordinierte Interaktion von LAP2alpha, LAP2beta und Laminen für den Aufbau der Kernstruktur und die Chromatinorganisation notwendig sind. In diesem Projekt haben wir die Interaktion von LAP2alpha mit Chromatin genau charakterisiert. Wir haben die Bindungsstelle in LAP2alpha eingeengt, neue chromosomale Bindungspartner von LAP2alpha identifiziert und die Regulation dieser Interaktion durch Phosphorylierung im Zellzyklus studiert. Die Bedeutung der Interaktion von LAP2alpha mit Chromosomen für die Zellproliferation und für den Kernaufbau wurde dadurch untermauert, dass Expression von Bindungsdomänen in humanen Zellen einen Proliferations-stop und Zelltot auslösten. Wir zeigten auch, dass LAP2alpha spezifisch mit jenen Laminproteinen assoziiert, die in verschiedenen menschlichen Erbkrankheiten (Laminopathien) mutiert sind, und Muskelschwäche, Herzreizleitungsstörungen und Degeneration des Fettgewebes verursachen. Die molekularen Ursachen dieser Erkrankung sind völlig unbekannt. Unsere Studien weisen darauf hin, dass Lamin-LAP2alpha Komplexe im Kern funktionelle Einheiten darstellen, die die Kernstruktur, die Transkription und die Zellproliferation regulieren können. Da Laminmutationen diesen Komplex wahrscheinlich zerstören und dadurch die LAP2alpha Funktion beeinflussen, kann man über die Analyse der zellulären Funktionen von LAP2alpha Fortschritte in der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die zum zellulären Krankheitsbild führen, erzielen. Diese Hypothese wird zur Zeit im Labor intensiv untersucht.