Enzymstabilitäten und Möglichkeiten der Aufarbeitung von Enzymen durch Behandlung mit überkritischem CO2

Die Verwendung von Enzymen als Katalysatoren im überkritischen CO 2 stellt ein Forschungsgebiet dar, dem nun bereits seit 1985 steigende Bedeutung beigemessen wird. Trotz zahlreicher Arbeiten, in denen gezeigt werden konnte, daß enzymatische Katalyse in überkritischem CO 2 in einem breiten Temperatur- und Druckbereich durchgeführt werden kann, und dem Wissen über die Hauptfaktoren, die zu einer Enzyminaktivierung führen (hohe Temperaturen, hohe Feuchtigkeit und Kompressions-/Entspannungsschritte), liegen bisher nur wenige vergleichende Daten über die Stabilitäten verschiedener Enzyme vor. In vor kurzer Zeit am Institut durchgeführten Vorarbeiten ist versucht worden, unter gleichen Versuchsbedingungen mehr Information über Enzymstabilitäten zu erhalten. Es ist beabsichtigt, diese Arbeiten in der Richtung weiterzuführen, daß die Eignung von bisher nicht verwendeten oder selten eingesetzten Enzymen (Esterasen, Cholesterinesterase) als Bio-katalysatoren in überkritischem CO 2 getestet wird. Weiters soll festgestellt werden, ob es sich durch Vergleich der Stabilitäten lohnt, teure Enzyme mit hoher Reinheit (hoher Aktivität) anstatt von billigen Enzymen mit geringer Reinheit für die enzymatische Katalyse einzusetzen. Am Institut wurde festgestellt (bisher nicht publiziert), daß bei Enzymen mit sehr geringer Reinheit nach Behandlung mittels Hochdruckextraktion (CO2 ) ein Anstieg der Aktivität beobachtbar ist. Ziel ist es dieses Verfahren so zu optimieren, daß damit Enzyme aufgearbeitet werden können. Dazu müssen Aktivitätsmessungen mit einer biophysikatischen Charakterisierung (Fluoreszenzspektroskopie, Elektronenspinresonanzspektroskopie und Kalorimetrie) der Enzyme kombiniert werden, um zu garantieren, daß unter diesen Bedingungen keine Veränderungen am Protein selbst auftreten. Weiters wird die Durchführbarkeit der folgenden Reaktionen getestet: 1. Veresterung von Palimitinsäure mit Cholesterin zu Cholesterylpalmitat (Cholesterinesterase) 2. Herstellung von 4-Nitrophenylbutyrat aus 4-Nitrophenot und Buttersäure (Esterase) 3. Umsetzung von Glycerin mit Palmitinsäure zu Palmitin (Lipase).

Die Verwendung von Enzymen als Biokatalysatoren in überkritischem Kohlendioxid (SC-CO2) ist ein neues Forschungsgebiet mit weitreichender Beachtung, welches erstmals 1985 veröffentlicht wurde. Obwohl in verschiedenen Studien gezeigt wurde, dass die enzymatische Katalyse in SC-CO2 über einen weiten Druck- und Temperaturbereich angewandt werden kann, existieren bis dato wenig Daten für den Vergleich der Enzymstabilität unterschiedlicher Enzyme. In diesem Projekt wurde der Einfluß von zwei Parametern auf die Enzymstabilität in SC-CO2 untersucht. Zum einen wurde die Enzymstabilität in Abhängigkeit der Anzahl der Disulphidbrücken im Enzymmolekül untersucht, basierend auf der publizierten Hypothese einer Deutschen Forschungsgruppe, dass Enzyme mit Disulphidbrückenbindungen stabiler sind. Zum anderen wurde die Feuchtigkeit des SC-CO2 untersucht, da Wasser eine entscheidende Rolle in der Biokatalyse spielt: es ist für eine katalytische Wirkung notwendig, kann aber das Enzym deaktivieren, wenn ein gewisser Wassergehalt überschritten wird. Weiters wurde untersucht, ob der Einsatz teurer Enzyme mit einer hohen Reinheit (hohe Aktivität) anstelle billiger Enzyme mit geringer Reinheit einen Vorteil für die enzymatische Katalyse mit sich bringt, da höhere Reinheiten eine höhere Instabilität der Enzympräparationen mit sich bringen. Aufgrund der Stabilität vieler Enzympräparationen wurde die Aufreinigung von Rohenzymen mittels überkritischer CO2 Extraktion untersucht. Die Messungen der Enzymaktivitäten wurden mit der biophysikalischen Charakterisierung (Fluoreszenzspektroskopie, Gelelektrophorese, Anzahl der freien Aminogruppen / Carbonylgruppen / Thiolgruppen) kombiniert, um zu garantieren, dass unter den Extraktionsbedingungen keine Änderung des Proteins auftritt. Einige biokatalytische Reaktionen wurden in SC-CO2 getestet, wobei Esterasen und Lipasen für Veresterungs- und Umesterungsreaktionen angewandt wurden.