Mechanismus und biologische Signifikanz der S-Nitrosierung

Im Unterschied zu den meisten zellulären Botenstoffen, deren biologische Wirkung auf einer spezifischen Interaktion mit Ligandenbindungsstellen von Proteinen beruht, bewirkt NO eine chemische Veränderung von Zellbestandteilen. Daher ist das Verständnis der biologischen Chemie von NO entscheidend für das Verständnis der Physiologie und Pathophysiologie von NO. Die Wirkungen von NO beruhen auf chemischen Reaktionen mit Sauerstoff (O2 ), Superoxidanion (O2 - ) und Metall-Zentren von Enzymen. Die Reaktion mit O2 führt bei pathophysiologisch erhöhten NO-Konzentrationen zur Bildung nitrosierender Intermediate, die an der Mutagenität und anderen toxischen Effekten von NO beteiligt sind. Die Reaktion mit O2 - ist sehr schnell und resultiert in der Bildung von Peroxynitrit, einer hochreaktiven Spezies, die eine Oxidation verschiedener Biomoleküle sowie die Nitrierung von Tyrosin-Resten in Proteinen bewirkt. Die Reaktivität von Peroxynitrit ist wahrscheinlich an Gewebeschädigungen beteiligt, die im Zuge verschiedener kardiovaskulärer, neuronaler und anderer Erkrankungen durch eine Überproduktion von NO und O2 - ausgelöst wird. Die prosthetische Häm-Gruppe der 1öslichen Guanylatcyclase ist das wichtigste Beispiel für Protein-assoziierte Metall-Komplexe, die durch NO beeinflußt werden. Durch die hochaffine Bindung von NO an das Häm-Eisen wird das Enzym aktiviert und vermehrt cGMP gebildet. Dieser zelluläre Botenstoff ist an der Regulation unterschiedlichster biologischer Prozesse beteiligt, z. B. an der Relaxation von Blutgefäßen, der Aggregation von Blutplättchen und Lernvorgängen. Im Rahmen des vorliegenden Projektes sollen Untersuchungen zur Biosynthese, zum zellulären Transport und zur Metabolisierung von S-Nitrosothiolen durchgeführt werden. S-Nitrosothiole fungieren wahrscheinlich als relativ stabile Speicher- und Transportformen von NO, können aber unter bestimmten Bedingungen auch NO freisetzen und dadurch cGmp-vermittelte Wirkungen auslösen. Trotz der großen physiologischen und pathophysiologischen Bedeutung von Nitrosothiolen, weiß man nur wenig über die molekularen Mechanismen der Biosynthese dieser Verbindungen sowie über deren Schicksal in Zellen und Geweben. Dieses Projekt soll einerseits zu einem besseren theoretischen Verständnis dieser Prozesse beitragen und andererseits neue Wege für die Entwicklung und Anwendbarkeit von Pharmaka zur spezifischen Beeinflussung dieser Prozesse in vivo aufzeigen, um dieses Gebiet auch der experimentellen Pharmakologie zugänglich zu machen.

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein weit-verbreitetes Signalmolekül, das an so unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt ist wie der Regulation des Blutdrucks, der Aggregation von Blutplättchen, der Neurotransmission im Gehirn, der Peniserektion und der Immunisierung gegen Pathogene. Neben diesen wichtigen physiologischen Funktionen hat NO auch schädliche Wirkungen, und dessen Überproduktion ist an der Entstehung zahlreicher entzündlicher, infektiver und neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt. Im Unterschied zu anderen zellulären Signalmolekülen, die über spezifische Interaktionen mit Bindungsstellen von Zielproteinen wirken, beruhen die biologischen Effekte von NO auf chemischen Reaktionen mit Zellbestandteilen, sodass für das Verständnis der biologischen Wirkungen von NO die Kenntnis der biologisch relevanten chemischen Reaktionen wesentlich ist. Im Rahmen dieses Projekts haben wir die Mechanismen und die biologische Relevanz einer chemischen Reaktion von NO, und zwar der S-Nitrosierung, untersucht. Ähnlich wie die bekannte N-Nitrosierung, die zur Bildung cancerogener Nitrosamine führt, bewirkt die S-Nitrosierung potentiell gefährliche Modifikationen von Zellbestandteilen mit essentiellen Sulfhydryl-Gruppen (Proteine und niedermolekulare Thiole wie Glutathion). Wir haben uns besonders mit den zellulären Bedingungen für S-Nitrosierung und die mögliche Bedeutung dieser Reaktion für die physiologischen Effekte von NO beschäftigt. Diese Effekte werden durch Aktivierung der löslichen Guanylatcyclase vermittelt, einem Enzym das aus Guanosintriphosphat (GTP) den intrazellulären Botenstoff cGMP bildet und durch NO aktiviert wird. Das wesentliche Ergebnis der Projektarbeiten betrifft den Mechanismus der zellulären S-Nitrosierung. Wir konnten zwei entscheidende Wege identifizieren, die durch NO-Autoxidation bzw. Superoxid-Anionen ausgelöst werden. Autoxidation von NO findet bei NO-Überproduktion in entzündetem Gewebe oder im Zuge bakterieller Infektionen, die mit Induktion der NO-Synthese einhergehen, statt. Mittels aufwendiger biophysikalischer Methoden konnten wir das Stickstoffdioxid-Radikal als aktive Spezies identifizieren. Der zweite Weg findet bereits bei niedrigen NO-Konzentrationen statt, erfordert aber die gleichzeitige Bildung von Superoxid-Radikalen, die in entzündetem Gewebe als reaktive Spezies gebildet werden. Unsere Befunde zeigen, dass NO und Superoxid zu dem potenten Cytotoxin Peroxynitrit reagieren, das Thiole zu den entsprechenden Thiyl-Radikalen oxidiert, die mit NO sehr S-Nitrosothiole bilden. Unsere Untersuchungen lieferten keine Hinweise auf eine Beteiligung der S-Nitrosierung an physiologischen Effekten von NO, sodass mit dieser Reaktion interferierende Pharmaka Bedeutung als neuartige Arzneimittel für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen haben könnten. Zur Zeit testen wir die protektiven Effekte mehrerer Verbindungen, vor allem von polyphenolischen Substanzen, die in niedriger Dosierung sehr effizient Stickstoffdioxid-Radikale abfangen.