Toxinresistente Histon Deacetylasen filamentöser Pilze

Die DNA eukaryontischer Organismen wird mit Hilfe kleiner basischer Proteine, den Histonen organisiert. Histone können z.B. durch Phoshorylierung, Glykosilierung, Ubiquitinierung, ADP-Ribosylierung oder Acetylierung postsynthetisch modifiziert werden. Die reversible Histon Acetylierung wird durch Histon-Acetyltransferasen (HAT) bzw. Histon-Deacetylasen (HD) katalysiert. HATs spielen für die Aktivierung der Transkription eine wesentliche Rolle, HDs sind für deren Reprimierung mitverantwortlich, wobei der genaue Mechanismus aber noch ungeklärt ist. Verschiedene Hemmstoffe von HDs (z.B. Butyrat, Trichostatin, zyklische Tetrapeptide) besitzen u.a. antineoplastische Wirkung. Interessanterweise sind HDs aus dem maispathogenen, filamentösen Pilz Cochliobolus carbonum im Gegensatz zum nahe verwandten Aspergillus nidulans gegenüber solchen Toxinen unempfindlich. C. carbonum besiedelt Maiszellen, indem Mais HDs vermutlich durch das vom Pilz synthetisierte HC-Toxin gehemmt werden. Wir werden deshalb toxinresistente HDs aus C. carbonum und toxinempfindliche HDs aus A. nidulans untersuchen, um mehr über deren Struktur (aktives Zentrum, Toxin-Bindungsstelle) und ihre Wirkungsweise zu erfahren. Das Ziel dieses Projektes wird es deshalb sein, Histon-Deacetylasen aus diesen beiden Organismen biochemisch, immunologisch und enzymatisch zu charakterisieren und zu isolieren, um weiters deren kodierende Gene zu analysieren und die aktiven Zentren und die Toxin-Bindungsstellen dieser Enzyme zu identifizieren. Dadurch sollte es möglich sein, den Resistenzmechanismus aufzuklären und eventuell die Grundlage für die Synthese spezifischer Hemmstoffe als Chemotherapeutika zu liefern.

Die Histonacetylierung stellt einen wichtigen Mechanismus für wesentliche zelluläre Prozesse wie der Transkription oder der Replikation dar. Zusätzlich konnte ein direkter Zusammenhang zwischen einer fehlgeleiteten Histonacetylierung und bestimmten malignen Krankheiten nachgewiesen werden. Ein wichtiges Hilfsmittel für solche Untersuchungen sind spezifische Hemmstoffe von Histondeacetylasen (HDACs). Zu diesen Hemmstoffen gehört auch das HC-Toxin, das vom maispathogenen Pilz Cochliobolus carbonum produziert wird. Aufgrund der Tatsache, dass C. carbonum neben hemmstoffempfindlichen auch HC-Toxin resistente HDACs exprimiert, wurde im Laufe dieses Projektes der Frage nachgegangen, um welche HDAC es sich bei der resistenten Aktivität handelt. Weiters wurde versucht, Hinweise für die Aufklärung des Resistenzmechanismus zu erhalten. Verschiedenste biochemische Untersuchungen und Analysen von Mutanten in C. carbonum erbrachten Hinweise für eine Beteiligung von HDC4 (homolog zum Hefeprotein HOS3) an der Resistenz. Eine Deletionsmutante des HDC4 führt nämlich zu einem Verlust der resistenten Aktivität nach einer biochemischen Aufreinigung. Für eine mögliche Beteiligung von HDC4 an der Resistenz spricht weiters die ungewöhnliche Länge des Gens: das hdc4 kodiert für ein 128 kDa Protein während die homologen Enzyme aus Hefe und Aspergillus wesentlich kürzer sind. Folglich könnte HDC4 eine Struktur aufweisen, die es gegenüber Hemmstoffen schützt. Neben dieser "intrinsischen" Resistenz scheint es aber auch einen oder mehrere externe Faktoren in C. carbonum zu geben, die unabhängig von der HDC4-Aktivität einen Schutz vor HDAC-Hemmstoffen verleihen. Es konnte nämlich gezeigt werden, dass die Unempfindlichkeit von HDACs gegenüber HC-Toxin in C. carbonum ein integraler Bestandteil der HC-Toxin Produktion und folglich der Pathogenität ist. Die Expression von hemmstoffresistenten HDACs und externer Faktoren repräsentieren folglich wichtige Schutzmechanismen gegenüber dem wirtseigenen Toxin.