Rolle von Metallionen in RNA-Ligand Wechselwirkungen

RNA besitzt die Fähigkeit sich zu komplexen Strukturen zu falten und dadurch eine Reihe von Liganden niedrigen Molekulargewichts zu binden. Zu diesen Liganden gehören vor allem RNA-bindende Antibiotika. Eine Schlüsselrolle bei der Faltung und bei der katalytischen Aktivität von RNA Molekülen spielen zweiwertige Metallionen, allen voran Magnesium. In dem hier vorgeschlagenen Projekt wollen wir die Rolle dieser Metallionen bei der Bindung von Liganden an verschiedene, RNA Moleküle untersuchen. Vier komplementäre Ansätze werden unternommen. 1. Aminoglykoside inhibieren sowohl die Ablesung des genetischen Codes als auch die autokatalytische Aktivität von Gruppe I Ribozymen. Die gemeinsame Eigenschaft der Ribosomen und des Ribozyms, die zu dieser gemeinsamen Sensitivität führt, wird hier mit Hilfe eines Austauschexperimentes untersucht. Die Dekodierungsstelle des Ribosoms wurde in das Gruppe I Ribozym eingeführt, dessen funktionell-äquivalente Domäne ersetzend. Daraus resultierte ein aktives Ribozym. Die Eigenschaften dieses neuen Moleküls werden nun kinetisch genau untersucht. 2. Im katalytischen Kern des Gruppe I Ribozyms werden zwei essentielle Magnesium Ionen koordiniert. In eine der Koordinierungsstellen wird eine 2-Aminopurinmodifizierung eingebaut, die nach unseren Vorkenntnissen aktiv sein sollte. Mit Hilfe dieser Modifizierung werden wir Fluoreszensspektroskopische Messungen machen können, da 2-Aminopurin ein fluoreszierendes Nukleotid ist. Die Dynamik der Magnesium-abhängigen Faltung wird spektroskopisch verfolgt werden. 3. Zwei kleine Ribozyme, das Hammerkopfribozym und das aus dem Hepatitis Delta Virus abgeleitete Ribozym, werden durch Neomycin B und Tetrazyklin inhibiert. Bei diesem Inhibitionsmechanismus spielen wiederum Metallionen eine wichtige, Rolle. Der Mechanismus der Inhibition wird durch Verwendung unterschiedlicher zweiwertiger Metallionen mit unterschiedlichen Affinitäten zu Tetrazyklin untersucht. 4. Durch in vitro Selektion konnte ein kleines Streptomycin-bindendes RNA Molekül isoliert werden, welches kooperativ auch noch Magnesium bindet. Durch Fluoreszensanalyse soll diese Bindungsweise analysiert werden.

Ribonukleinsäuremoleküle (RNA) falten sich zu komplexen drei-dimensionalen Strukturen, welche Bindungstaschen für kleine Liganden, z.B. Antibiotika, bilden. Zweiwertige Metallionen spielen eine Schlüsselrolle in the Faltung dieser drei-dimesionalen Strukturen und in der Ligandenbindung. In dem beschriebenen Projekt haben wir die Wechselwirkung dieser kleinen Moleküle mit RNA untersucht und uns auf die Rolle von Magnesiumionen im Bindungsprozess konzentriert. Wir haben mehrere Ansätze unternommen um dieser fundamentalen Eigenschaft von RNA Molekülen auf die Spur zu kommen. Da RNA Moleküle aus multiplen unabhängigen Domänen bestehen, haben wir die Dekodierungsstelle der 16S ribosomalen RNA, der wichtigsten Antibiotikabindestelle am Ribosom, herausgeschnitten und in ein Gruppe I Intron, eine weitere funktionelle RNA, übertragen. Dieses Experiment zeigte uns die Substratbindungseigenschaften der Intron RNA, nämlich, daß dieses Molekül ein Faltungsproblem hat. Eine Substratbindungsinhibierung entsteht durch die Kompetition zweier "Hairpins", P1 und P2, die dazu führt, daß die Faltung dieser Domäne zum geschwindigkeits-bestimmenden Schritt in der Reaktion wird. Wir haben weiters eine neue Methode zur Untersuchung von Metallionenbindestellen in RNA Molekülen evaluiert. Bei dieser Methode werden RNA Moleküle in Gegenwart von Uranylionen gefaltet und mit 420 nm Licht bestrahlt. Dabei wird das RNA Rückgrad in der Nähe der Uranylionen gespalten. Diese Methode wurde mit fünf verschiedenen RNA Molekülen evaluiert, von denen Röntgenstrukturen existieren. Wir konnten daraus schließen, daß diese Methode nur partiel geeignet ist um Metallionenbindestellen zu bestimmen, da nicht alle Bindestellen aufscheinen. Die Methode ist aber sehr gut geeignet um flexible Regionen der RNA zu detektieren. Weiters haben wir eine Intronmutante untersucht, die potentiel einen Fehler am katalytischen Schritt aufweist. Wir haben zwei Eigenschaften dieser Mutante gefunden, die vermuten lassen, daß die mutierte Base an der nukleophilen Aktivierung des Guanosinkofaktors beteiligt ist. Einen letzten Ansatz bestand in der spektroskopischen Untersuchung von Antibiotika-RNA Wechselwirkungen. Kleine in vitro selektierte Antibiotika-bindende RNAs sind mittels UV-Schmelzkurven, CD Spektren und Fluoreszensspektroskopie untersucht worden. Diese Experimente sind ein vielversprechender Beginn für zukünftige Projekte und gaben einen ersten Einblick in die Vielfalt der spektroskopischen Methoden, die auf RNA angewandt werden können.