Glucosaminidase Regulation in Trichoderma harzianum

Der verbreitete Bodenpilz Trichoderma harzianum ist ein bekannter Mykoparasit, und wird aus diesem Grund und wegen seiner Unschädlichkeit gegenüber Pflanzen als Präparat für die Biokontrolle pflanzenpathogener Pilze eingesetzt. Die im Zuge der Verbesserung der eingesetzten Stämme durchgeführte Grundlagenforschung konnte dabei nachweisen, daß die Bildung von Enzymen, welche die Zellwand des Pflanzenpathogenen zu schädigen vermögen (besonders Chitinasen), sowie die Membranintegrität schädigende Sekundärstoffe funktionell an der Biokontrolle beteiligt sind. Der vorliegende Projektvorschlag zielt nun auf ein tieferes Verständnis der an der Bildung von Chitinasen durch Trichoderma harzianum beteiligten molekularen und biochemischen Vorgänge ab. Es soll mit Standardmethoden molekularer Genetik das für die Induktion verantwortliche DNA-Motif identifiziert, sowie das das an sie bindende Protein kodierende Gen isoliert und das Protein charakterisiert werden. Die angestrebten Kenntnisse würden nicht nur einen bislang dunklen Punkt im Verständnis der Biologie der Pilze näher beleuchten, sondern auch wertvolle Grundlagen für die Verbesserung von als biologische Pflanzenschutzmittel verwendeten Pilzen liefern (z.B. durch "Engineering" Signaltransduktion). Ferner könnten die Ergebnisse helfen Strategien für die rekombinante Verbesserung der natürlichen Abwehr der Pflanzen zu entwickeln. Und schließlich sollte nicht außer acht gelassen werden, daß Chitin eines der mengenmäßig häufigst vorliegenden Polysaccharide ist, dessen Hydrolyse und Modifikation durch Chitinasen auf industrieller Ebene vom Vorliegen Chitinase-überproduzierender Pilzstämme profitieren sollte.

In diesem Forschungsprojekt wurde eine DNA-Region identifiziert, die verantwortlich ist fuer die Kontrolle der Genexpression eines Chitinase-Gens in dem mykoparasitischen Biokontroll-Pilz Trichoderma atroviride (=T. harzianum P1). Weiters wurde ein neues Gen isoliert, das für ein Protein kodiert, welches an diese DNA-Region binden kann, aber keinen Einfluß auf die Regulation ausübt. Statt dessen ist dieses Protein vermutlich am Schutz des Organismus gegen bestimmte Stressfaktoren aus der Umwelt beteiligt. Das Chitinase-Gen (nag1, kodiert eine N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase) wird stark expremiert wenn der Pilz in Gegenwart von N-Acetyl-ß-D-Glucosamin, wächst (auch in niedrigsten Konzentrationen). N-Acetyl-ß-D- Glucosamin ist der Grundbaustein von Chitin, einem Biopolymer das einen Hauptbestandteil der pilzlichen Zellwand darstellt. Chitin abbauende Enzyme wie die N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase spielen eine wichtige Rolle im sog. Mykoparasitismus, also dem Bekämpfen und der Nutzung als Nahrungsquelle eines Pilzes durch einen anderen. Ziel des Projekts war die Identifikation und Charakterisierung bestimmter Motive in der Regulatorregion von nag1, die für die Kontrolle der Expression verantwortlich sind. Zuerst wurde eine Region von ca. 90 Nukleotiden, 200 - 290 Nukleotide vom eigentlichen Start des nag1-Gens, als notwendig für die gesteigerte Expression in Gegenwart von N-Acetyl-ß-D-Glucosamin identifiziert. Mittels experimenteller Verfahren, mit denen Protein-DNA-Interaktionen und -Bindungen sichtbar gemacht werden können, haben wir noch kürzere Bereiche von Nukleotiden identifziert, welche mit Proteinen interagieren und vermutlich bei der Regulation eine Rolle spielen. Die Position und Abfolge dieser kurzen Motive weist eine starke Ähnlichkeit mit der entsprechenden Situation im Promoterbereich des Kutinase-A-Gens des Pflanzenschädlings Haematonectria haematococca (Fusarium solani) auf. Die Funktion von Nag1 und der Kutinase ist vermutlich ähnlich, ebenso die Regulation. Wir haben daher ein Gen aus T. atroviride isoliert, dessen Sequenz der des Regulatorgens aus H. haematococca sehr ähnlich ist. Das isolierte Gen kodiert für ein Protein das an eines der identifzierten DNA-Motive binden kann. Ein Pilzstamm wurde konstruiert, in welchem das Gen, genannt seb1, zerstört wurde und welcher das entsprechende Protein Seb1 nicht mehr bilden kann. Dieser Stamm zeigte jedoch keine Abweichungen in der Expression der Chitinasegene, und die Interaktionen von Regulatorregionen mit Proteinen war intakt. Wir schliessen daraus, dass das Gen seb1 an der Regulation der Chitinasegene unbeteiligt ist. Um eine Funktion dieses Gens zu identifizieren, haben wir das Wachstum und die Morphologie des Ausgangsstammes mit dem des Stammes ohne seb1 Gen verglichen. Es wurde ein im Vergleich wesentlich stärker reduziertes Wachstum unter hoher Salzbelastung festgestellt. Wir schliessen daraus, dass das Gen bzw. sein Genprodukt am Schutz vor bestimmten Stressbedingungen beteiligt ist. Es erfüllt allerdings nicht dieselbe Funktion wie ein bekanntes Stress-Regulatorgen aus der Bäckerhefe.