Die Rolle der Adhäsionsmoleküle und NO bei Venentransplantation

Die autologe Venen-Transplantation ist oft die einzige chirurgische Alternative zur Wiederherstellung einer ausreichenden Blutversorgung für das Herz. Trotzdem folgt der Gefäß-Transplantation relativ oft die arteriosklerotische Stenosierung. Die Pathogenese dieser Transplant-Arteriosklerose ist zur Zeit noch nicht geklärt. In jüngster Zeit wurden von verschiedenen Forschern Maus-Modelle entwickelt, in welchen bestimmte Gene überexprimiert, deletiert oder mutiert wurden. Der Vorteil dieser Tiermodelle gegenüber herkömmlichen ist jener, daß hier bestimmte Faktoren bzw. Inhibitoren nicht zugeführt werden müssen, da diese oft problematisch und schwer zu quantifizieren sind. Wir haben ein Mausmodell entwickelt, welches uns die Möglichkeit gibt, sowohl die Pathogenese als auch therapeutische Interventionen bei der Transplant-Arteriosklerose zu untersuchen. Im vorliegenden Antrag wollen wir uns auf die Rolle des Endothels bei der Entstehung der Transplant-Arteriosklerose konzentrieren. Zuerst werden wir ein Mausmodell für die Transplant-Arteriosklerose entwickeln, indem wir die V. jugularis oder die V. cava zur A. carotis von Wildtyp C57BL/6J Mäusen transplantieren. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden die, in den arteriellen Kreislauf transplantierten Venen entnommen und mittels en face Immunfluoreszenz bzw. immunhistochemisch auf ihre Adhäsionsmolekül-Expression (ICAM-1, ELAM-1 und VCAM-1) untersucht. Weiters wird auch die Zusammensetzung der adhärierten Zellen untersucht. Zweitens werden wir, um den Effekt von endothelialen Adhäsionsmolekülen (ICAM und ELAM) bei der Transplant-Arteriosklerose zu untersuchen, ICAM-/- und ELAM-/- Mäuse als Gefäß-Spender bzw. -Empfänger verwenden. Der Grad der Arteriosklerose in den transplantierten Venen wird dann mit dem in Wildtyp-Mäusen verglichen. Drittens werden wir, um den Effekt von Stickstoff-Oxid (NO) bei der Transplant-Arteriosklerose zu untersuchen, eNOS-/- und iNOS-1-Mäuse verwenden. Der Grad der Arteriosklerose wird wiederum mit jenem in Wildtyp-Mäusen verglichen. Untersuchungen über die Proliferation und Apoptose der vaskulären glatten Muskelzellen, welche von ENOS- und INOS- Mäusen gewonnen werden, werden mit solchen von Wildtyp-Mäusen verglichen. Schließlich wollen wir mit Gentherapie-Experimenten beginnen, indem wir eNOS bzw. iNOS ex vivo in Venenabschnitte transferieren und diese dann in Mäuse transplantieren. Alle in diesem Projekt beschriebenen Techniken wurden bereits erfolgreich vom Autor angewendet, alle Reagenzien und Mäuse stehen uns zur Verfügung. Diese Studie ist sehr aktuell und könnte wichtige Informationen über die Bedeutung der Adhäsionsmoleküle und NO bei der Entstehung der Transplant-Arteriosklerose liefern. Solche Erkenntnisse könnten die Basis für zukünftige therapeutische Interventionen bei vaskulären Erkrankungen darstellen.

Autologe Venentransplantate bleiben die einzige chirurgische Alternative für viele Arten vaskulärer Rekonstruktionen. Der Erhalt der Durchgängigkeitsrate ist jedoch durch die postoperative Entwicklung obliterativer Stenosen der transplantierten Gefäße limitiert. Die Pathogenese der Erkrankung wird nur unvollständig verstanden, und es gibt bisher keine erfolgreichen klinischen Interventionsmöglichkeiten. Wir haben kürzlich das erste Mausmodell für Venenbypass-Arteriosklerose entwickelt, das sich als sehr wertvoll erwiesen hat. Unter Verwendung dieses Modells in Gen-deletierten Tieren, wurde das aktuelle Projekt entworfen, um die Pathogenese von Venentransplantationsarteriosklerose zu studieren, mit besonderer Berücksichtigung der Rolle von Adhäsionsmolekülen und Stickstoffmonoxid. Das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) ist ein Oberflächenglykoprotein der Immunglobulinsuperfamilie. Die bisher bekannten wichtigsten Funktionen von ICAM-1 beziehen sich auf seine Rolle in Zelladhäsion und - migration. Viele Befunde weisen darauf hin, daß ICAM-1/MAC-1-abhängige zelluläre Interaktionen in einer Vielzahl von entzündlichen Prozessen und in der Entstehung von Arteriosklerose via mononukleären Zelladhäsionen und -interaktionen involviert sind. Es bleibt jedoch unklar, ob ICAM-1 in der Entwicklung von Venenbypassarteriosklerose eine kausale Rolle spielt. Mit Hilfe unseres Mausmodells studierten wir die Rolle von interzellulärem Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) in der Pathogenese von Venentransplantationsarteriosklerose in ICAM-1-defizienten Mäusen. Verglichen zu Wildtyp Kontrollen, waren in ICAM-1 -/- Mäusen die neointimalen Hyperplasien der Venentransplantate um 30 bis 50% reduziert. Immunofluoreszenzanalysen ergaben vermehrte ICAM-1 Expression im Endothel und glatten Muskelzellen (SMCs) von transplantierten Venen in Wildtyp-Mäusen, jedoch nicht in ICAM -/- Mäusen. Mac-1 (CD11b/18)-positive Zellen, die an der Oberfläche von Venentransplantaten in ICAM-1 -/- Mäusen adhärieren, waren in ICAM-1 -/- Mäusen signifikant vermindert, wie en face Immunfluoreszensanalysen ergaben. Diese positiven Zellen waren hingegen vermehrt in intimalen Läsionen von Venentransplantaten in Wildtyp-Mäusen. Wenn TNF-alpha-stimulierte SMCs mit Maus Milzleukozyten inkubiert wurden, war die Zahl von adhärenten Zellen an ICAM-1 -/- SMCs signifikant niedriger im Vergleich zu ICAM-1 +/+ SMCs. Dieser Effekt konnte deutlich durch Vorbehandlung der Leukozyten mit einem anti-MAC-1 Antikörper inhibiert werden. Matrix-Metalloproteasen (MMPs) können den Großteil der vaskulären extrazellulären Matrix-Komponenten degradieren, einschließlich Elastin und Kollagen. Ihre Expression kann durch das Zusammenspiel von Entzündungszellen und Zytokinen, die in Venentransplantaten präsent sind, reguliert werden. Unter Verwendung unseres Mausmodells studierten wir die Effekte von lokalem Gentrasfer von TIMP-2 auf das Venentransplantat- `Remodeling`. Isogene Mausgefäße der Vena cava wurden End-zu-End in die Arteria Carotis implantiert und dann mit replikationsdefekten, rekombinanten Adenoviren, die TIMP-2 (RAdTIMP-2) oder beta-Galaktosidase (RAdLacZ) überexprimieren, eingehüllt. In der unbehandelten Gruppe konnte eine Verdickung der Gefäßwand bereits eine Woche nach der Operation beobachtet werden. Diese nahm im weiteren Verlauf nach 4 und 8 Wochen nach der Operation respektive 4 und 10-fach an Dicke zu. RAdLacZ-Vektor-Behandlung bewirkte eine signifikante Vermehrung neointimaler Läsionen nach 8 Wochen, die durch RAdTIMP-2-Genüberexpression vollständig inhibiert werden konnte. Interessanterweise resultierte RAdTIMP-2-Gentransfer in einer Reduktion des Gefäßdurchmessers der Venentrasplantate. Somit erwies sich dieses Mausmodell nützlich für Gentransferstudien. Unsere Befunde demonstrieren, daß lokaler TIMP-2 Gentrasfer signifikant den Venentransplantationsdurchmesser reduzieren kann, d. h. es entsteht ein `Remodeling` hin zu einem arterienähnlichen Gefäß via der Inhibition von Matrix-Metalloproteinasen Aktivität. Zusammengefaßt liefern wir die erste Evidenz, daß ICAM-1 einen kritischer Parameter in der Entwicklung von Venenbypass-Transplantatsarteriosklerose darstellt. Dies ist eine essenzielle Information für Interventionen in Venentransplantationsarteriosklerose in Patienten, die sich einer Bypassoperation unterziehen müssen. Wir liefern weiters als erste die Evidenz, daß dieses Modell zum Studium der Gentherapie für Venentransplantationsarteriosklerose eingesetzt werden kann.