Schutzmechanismen in Stickstoff-fixierenden Cyanobakterien gegen teilreduzierte Sauerstoffspezies

Stickstoff-fixierende Cyanobakterien spielen eine wichtige Rolle im globalen Stickstoff-Kreislauf. Symbiotische und freilebende marine Cyanobakterien tragen vermutlich mehr zur globalen Stickstoff-Fixierung bei als alle anderen Stickstoff-fixierenden Bakterien zusammen. Das Enzym dafür ist die Nitrogenase, welches jedoch schnell und irreversibel durch molekularen Sauerstoff und reaktive Sauerstoff-Verbindungen inaktiviert wird. In diesem Projekt dient Anabaena variabilis, ein filamentöses Cyanobakterium, das Stickstoff in spezialisierten Zellen, den Heterocysten, fixiert, als Untersuchungsobjekt, um die Enzyme für die Beseitigung reaktiver Sauerstoff- Verbindungen zu untersuchen. In Chloroplasten werden solche Sauerstoff-Verbindungen durch Ascorbat und einem Ascorbat-regenerierenden System zerstört, welches Superoxid-Dismutase, Ascorbat-Peroxidase, Monodehydroascorbat-Reductase, Dehydroascorbat-Reductase und Glutathion-Reductase beinhaltet. Es wird vermutet, daß ein ähnliches System auch in Cyanobakterien aktiv ist. Eine Kombination von chromatographischen Methoden dient zur Reinigung der Enzyme. Es folgen biochemische Analysen, um folgende Größen der gereinigten Enzyme zu bestimmen: Lokalisierung, molare Masse und Zusammensetzung aus Untereinheiten, mögliche Substrate, kinetische Größen, Einfluß von Temperatur, lonenstärke und pH-Wert auf die Enzymaktivität, Hemmstoffe, Aminosäure-Sequenz, Herstellung von Antikörpern gegen die gereinigten Enzyme und Immunogold-Labeling. Weiters soll der Einfluß von verschiedenen Wachstumsbedingungen, wie hoher Sauerstoff-Konzentration, oder Zugabe von Wasserstoffperoxid oder Radikalbildnem, untersucht werden. Somit kann das mögliche Anpassungspotential von Cyanobakterien an höhere Konzentrationen von reaktiven Sauerstoff-Verbindungen erforscht werden. Auch ist es dadurch möglich, mehr über dessen Einfluß auf die Nitrogenase zu erfahren.

Cyanobakterien, besser bekannt als Blaualgen, sind mikroskopisch kleine blaue ("cyano") Bakterien, die bereits vor mehr als drei Milliarden Jahren existierten. Ihr Erscheinen auf einer damals sehr unwirtlichen (sauerstofffreien, d.h. anaeroben) Erde bildete eine entscheidende Voraussetzung für die Entwicklung höherer Organismen. Cyanobakterien waren nämlich Pioniere der Sauerstoffproduktion. Sie "erfanden" quasi die heute noch von allen Pflanzen durchgeführte Photosynthese, mit der mit Hilfe von Licht Kohlendioxid und Wasser in Kohlenhydrate umgewandelt wird. Sauerstoff entstand dabei als Abfallprodukt. Cyanobakterien spielen auch heute noch eine wichtige Rolle in den auch für den Menschen so wichtigen Stoffkreisläufen. Neben den Pflanzen spielen sie eine wichtige Rolle in der Produktion des atmosphärischen Sauerstoffs, sie sind aber auch dafür verantworlich, daß Kohlendioxid aus unserer Atmosphäre (Stichwort Treibhauseffekt) wieder entfernt wird. Und zusätzlich können einige Blaualgen auch Stickstoff fixieren, eine biochemische Reaktion, die nur von Bakterien katalysiert wird und die den Stickstoff in eine für höhere Pflanzen erst verwertbare Form umsetzt. So sind Cyanobakterien nicht nur für den Verlauf der Evolution bedeutend, sondern haben auch enorme Wichtigkeit im sensiblen ökologischen Gleichgewicht unserer Erde. Stickstofffixierende Cyanobakterien können neben normalen ("vegetativen") auch spezialisierte Zellen, sog. Heterocysten, ausbilden. Die notwendige Enzymausstattung der Heterocysten (z.B. das Enzyme Nitrogenase) muß allerdings effektiv vor Sauerstoff und toxischen Folgeprodukten (Superoxid, Wasserstoffperoxid) geschützt werden. Ziel dieses Projekts war die Ermittlung der enzymatischen Grundausstattung einer representativen Spezies, Anabaena variabilis, die es dem Bakterium ermöglicht, sowohl photosynthetisch aktiv zu sein (und dabei Sauerstoff freizusetzen) und bei Bedarf Stickstoff zu fixieren. Durch genetische und biochemischen Methoden konnten die beteiligten Enzyme erfolgreich identifiziert, sequenziert und schließlich in E. coli überexprimiert werden. Anabaena variabilis enthält im Cytosol von vegetativen Zellen und Heterocysten eine eisenhältige Superoxiddismutase (Fe- SOD) und eine Thioredoxin Peroxidase. Die Fe-SOD ist ein Homodimer (2 23 kDa) mit hoher spezifischer Aktivität und Homologie zu anderen prokaryontischen FeSODs. Die Funktion dieses Enzyms liegt in der effizienten Dismutation von toxischen Superoxid-Radikalen (Abfallprodukt der Photosynthese) in Sauerstoff und Wasserstoffperoxid. Letzteres wird dann durch Thioredoxin Peroxidase zu Wasser reduziert. Thioredoxin Peroxidase in Anabaena ist ein saures, homodimeres Protein, das zwei redox-aktive Cystein-Reste im aktiven Zentrum enthält und mit Hilfe des Proteins Thioredoxin Wasserstoffperoxid in unschädliches Wasser umwandelt. Interessanterweise fehlen in Anabaena übliche Häm-enthaltende Peroxidasen und/oder Katalasen, die normalerweise diese Aufgabe übernehmen. Zusätzlich konnte in Anabaena erstmalig eine membrangebundene manganhältige Superoxiddismutase (Mn-SOD) identifiziert und rekombinant produziert werden. Vegetative Zellen als auch Heterocysten enthalten membrangebundene Mn-SOD in etwa gleicher Menge. Von allen drei Enzymen sind umfangreiche Struktur-Funktionsbeziehungen und Kristallisationsversuche durchgeführt worden. Die räumliche Struktur der Mn-SOD mit einer Auflösung von 2.0 Å konnte bereits erfolgreich ermittelt werden.