Eintritt und uncoating von Picornaviren

An Hand von drei verschiedenen Picornaviren sollte der Eintrittsmechanismus und die Freisetzung des viralen Genoms untersucht werden: 1/ HRV14, ein humanes Rhinovirus (HRV) der "major receptor group", 2/ HRV2, ein humanes Rhinovirus der "minor receptor group" und 3/ Poliovirus Typ 2 (PV2). 1. Mit Hilfe von mutanten HeLa-Zellen, die einen Defekt in der Clathrin-abhängigen Aufnahme haben, haben wir den Eintrittsweg von HRV2 untersucht. HRV2 wurde in diese mutanten Zellen aufgenommen und konnte diese Zellen auch infizieren. Daraus kann man schliessen, dass der infektiöse Eintrittsweg von HRV2 über einen Clathrin-unabhängigen Weg erfolgt. Das ist insofern bemerkenswert, da die Rezeptoren für HRV2 (u.a. LDL- Rezeptoren ) Proteine sind, welche ihre physiologischen Liganden, die Lipoproteine (z.B. LDL), nur Clathrin- abhängig in die Zelle aufnehmen. 2. Die Bedingungen und die intrazellulären Kompartimente, wo das Uncoating von HRV14 und HRV2 stattfindet, wurde in HeLa Zellen untersucht. Das Uncoating von HRV14 erfolgt Rezeptor-abhängig aber pH-unabhängig in frühen Endosomen. HRV2 dissoziert nach Rezeptor-vermittelter Aufnahme in frühen Endosomen von seinen Rezeptor ab and wird in späte Endosomen weitertranspostiert. Dort kommt es durch den niedrigem pH Wert aber unabhängig vom Rezeptor zur Freisetzung des Genoms. 3. Weiters wurde der Austrittsmechanismus modifizierter Viren bzw des viralen Genoms von HRV2, HRV14 und PV2 aus den Endosomen ins Zytoplasma charakterisiert. Dazu wir haben einen zwei-Stufen flow-zytometrischen Assay etabliert. Die Eignung dieses Test wurde mit Adenovirus, von dem bekannt ist, dass es durch Zerplatzen der Endosomen ins Zytoplasma gelangt, überprüft. Mit Hilfe dieses Assays konnten wir zeigen, dass im Falle von HRV2 and PV2 die Endosomen intakt bleiben und nur das virale Genom freigesetzt wird. Bei HRV14 kam es wie bei Adenovirus zu einer Zerstörung der Endosomen. Weiters konnten wir zeigen, dass im Falle einer Zerstörung durch HRV14 oder Adenovirus das endosomale System innerhalb von 30 Minuten nach Virusaufnahme wieder regeneriert wird. Da Adenoviren aber auch andere Viren als Vehikel verwendent werden um "intakte" oder fremde Gene in Zellen einzuschleussen, kann die Effizienz einer derartigen Einschleussung mit unserem Assay sehr schnell untersucht und vor allem quantifiziert werden. Background: In die Familie der Picornaviren gehören viele humanpathogene Viren wie z. B. die Erreger des Schnupfens (humane Rhinoviren) und der Poliomyelitis (Polioviren). Über die frühen Ereignisse der Infektion von Picornaviren, wie Eintritt in die Zelle, Eindringen ins Zytoplasma und Freisetzung des viralen Genoms (= "Uncoating") ist noch sehr wenig bekannt. Damit eine Zelle infiziert werden kann, muss das Virus zuerst an die Zelloberfläche (an einen Rezeptor) binden. In den meisten Fällen kommt es dann zur Virusaufnahme in die Zelle über Bildung von Endosomen, das sind "Bläschen", die sich von der Zelloberfläche abschnüren. Aus den Endosomen, welche im Inneren ein saures Milieu besitzen, müssen entweder veränderte ("aufgelockerte") Viruspartikel oder nur das Genom der Viren ins Zytoplasma freigesetzt werden. Danach können im Zytoplasma neue, infektiöse Picornaviren gebildet werden. Die Effizienz der Freisetzung ins Zytoplasma ist jedenfalls entscheidend für die Effizienz der Virusneubildung.