Klonierung und Charakterisierung von xif1 und xif2 von T.ree

Trichoderma reesei ist ein industriell bedeutender filamentöser Pilz der die Fähigkeit besitzt, ein Set von verschiedenem hydrolytischen Enzymen, wie zum Beispiel Cellulasen und Xylanasen, zu bilden. Zusätzlich macht ihn seine enorme sekretorische Kapazität (mehr als 40g/Liter eines einzelnen Enzyms) für verschiedenste Anwendungen in der Biotechnologie (e.g. heterologe Protein Produktion) besonders interessant. Die Hauptanwendungen der oben genannten hydrolytischen Enzyme liegen in der Nahrungs- und Futtermittelproduktion sowie in der Papier- und Textilindustrie. Viele enzymatisch unterstützte Technologien stellen eine umweltfreundliche Alternative zu rein auf chemischem Methoden basierenden Verfahren dar. Eine unbedingte Voraussetzung für deren Anwendung ist jedoch die Herstellung von maßgeschneiderten Enzym- Cocktails, die sich exakt an die jeweiligen Bedingungen des Produktionsverfahrens anpassen. Ein typisches Beispiel ist die Erzeugung von cellulasefreien Xylanase Präparaten für die Papier- und Faserindustrie. Dieses Ziel ist oft schwierig zu erreichen, da T. reesei wie bereits erwähnt einem ganzen Satz der entsprechenden Enzyme herstellt, und deren Expression zusätzlich teilweise co-reguliert abläuft. Gentechnisch veränderte Stämme welche die gewünschten Enzyme Cocktails produzieren wären eine vielversprechendes Werkzeug um diese Probleme zu überwinden, aber eine einfache "Gen knock-out" Strategie, ist nicht zielführend da die Anzahl der zu deletierenden Gene zu groß ist. Wir haben uns daher im Rahmen dieses Projekts mit der transkriptionellen Regulation der beiden wichtigsten Xylanasen (xyn1, xyn2) von T. reesei befaßt, um über eine Isolation und Charakterisierung der Schlüsselfaktoren der Genexpression von xyn1 und xyn2 die grundlegenden Voraussetzungen zu schaffen derartige Stämme herzustellen zu können. T. reesei produziert hauptsächlich zwei Xylanasen, deren Expression in völlig unterschiedlicher Weise reguliert wird, wobei jedoch beidemale sowohl ein Repressions- wie auch ein Induktionsmechanismus zum Tragen kommt. Für das Gen xyn1 konnte ein spezifisches Element identifiziert werden, welches für die Induktion der Transkription bei Wachstum auf Xylan oder Xylose verantwortlich ist und starke Ähnlichkeit mit dem Faktor XlnR aus Aspergillus niger aufweist. Zusätzlich wurde eine CCAAT-Box als in die xyn1 Aktivierung einbezogenes allgemeineres Element identifiziert. Bei Wachstum auf Glukose unterliegt xyn1 einer vollständigen Abschaltung durch den "wide domain repressor" Cre1. XlnR sowie die entsprechenden CCAAT Bindungsproteine (Hap2/3/5) sind verantwortlichen für die Konstituierung des induktionsspezifischen Protein-DNA-Komplexes der unter allen Bedingungen (reprimiert, dereprimiert, induziert) ausgebildet wird, wohingegen das Cre1 Proteins nur unter reprimierenden Bedingungen seine Targetsequenz bindet. Daraus resultiert, daß das Umschalten zwischen dem reprimierten bzw. dereprimierten Zustand des xyn1 Gens durch Cre1 gesteuert wird, wohingegen die Induktion über den XlnR, Hap2/3/5 Komplex erfolgt. Da keine weiteren DNA Bindungsproteine am xyn1 Promotor identifiziert werden konnten jedoch eine eindeutige Veränderung des XlnR/DNA Komplexes unter induzierenden verglichen mit nicht induzierenden Bedingungen zu beobachten ist darf geschlossen werden, daß die Induktion über eine Modifikation von XlnR oder eine Protein/Protein Wechselwirkung erfolgt. Für die Regulation von xyn2 zeigt sich ein gänzlich unterschiedliches Bild. Es ist generell kein komplettes Abschalten dafür aber eine konstitutive Expression des System zu beobachten. Eine Induktion wird hier durch Xylan und durch Xylobiose nicht aber durch Xylose erreicht, aber auch Sophorose der beste Induktor der Cellulasen in T. reesei induziert die Expression von xyn2. Unsere Experimente konnten beweisen, daß ACE2 ein Faktor, der an der Cellulase Induktion von T. reesei beteiligt ist auch für die Aktivierung der xyn2 Transkription verantwortlich zu sein scheint. Zusätzlich konnte ein noch unbekanntes Element identifiziert werden, welches für die Repression der xyn2 Expression auf ihr konstitutive Niveau verantwortlich ist. Ein ebenfalls vorhandene CCAAT-Box ist an der Rekrutierung sowohl der negativ wie auch positiv wirkenden Faktoren beteiligt. Das Projekt führte zu einem verbesserten Verständnis der transkriptionellen Regulation der beiden wichtigsten Xylansen von T. reesei. Interrasanterweise konnten keine gemeinsamen Elemente oder Faktoren die an der Regulation der Expression von xyn1 und xyn2 beteiligt sind (ausgenommen den CCAAT-Boxen) nachgewiesen werden. Die regelnden Elemente und die Faktoren von xyn1 werden nicht durch die klassischen Cellulase Induktoren beeinflußt und sind folglich ein nützliches Hilfsmittel für die Konstruktion von rekombinanten T. reesei Stämmen mit maßgeschneiderten Hydrolaseexpressionsprofilen.