Struktur und Funktion von Stomatin

In diesem Projekt wurde die Struktur und Funktion des integralen Membranproteins Stomatin mit Hilfe von biochemischen, molekular- und zellbiologischen Methoden untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Stomatin strukturelle Eigenschaften hat, die es ihm ermöglichen, mit Membran-Mikrodomänen, sogenannten "lipid rafts", zu assoziieren. Lipid Rafts haben eine Cholesterin- und Sphingolipid-reiche Zusammensetzung und enthalten bevorzugt acylierte Proteine, wie Glycosylphosphatidylinosit (GPI)-verankerte Proteine und Kinasen der Src- Familie. Ein spezieller Typus von Lipid Rafts sind die Caveolae, Einstülpungen der Plasmamembran, die als Hauptprotein das Caveolin-1 enthalten. Stomatin hat viele gemeinsame Eigenschaften mit Caveolin-1: eine lange, hydrophobe Domäne, die cytoplasmatisch orientiert ist ("hairpin loop"), die Oligomerisation, Palmitoylierung, Unlöslichkeit in Detergentien und niedrige Dichte. Stomatin ist aber nicht in Caveolae zu finden, sondern in einem anderen Typ von Lipid Rafts. Wir untersuchten die subzelluläre Verteilung von Stomatin in epithelialen, endothelialen und hämatopoetischen Zellen, unter Verwendung der Immunfluoreszenz- und Immunelektronen- Mikroskopie. In epithelialen Zellen fanden wir zwei gleich große Bereiche der Stomatin- Expression, nämlich die Plasmamembran und kernnahe Vesikel, die mit einem Marker für "späte" Endosomen colokalisierten. Wenn wir GPI-verankerte Proteine an der Plasmamembran quervernetzten, dann wurden diese endocytiert und colokalisierten mit Stomatin. Daraus kann man schließen, dass Stomatin ein Hüllprotein einer spezifischen Untergruppe von Endosomen ist. In den hämatopoetischen Zellen fanden wir Stomatin hauptsächlich auf Granula und nur wenig an der Plasmamembran. Während Stomatin auf allen Arten von Granula der Neutrophilen zu finden war, war es bei ruhenden Thrombocyten spezifisch mit den alpha-Granula assoziiert. Es ist bekannt, dass diese Granula bei der Aktivierung mit der Plasmamembran fusionieren und ihren Inhalt ausschütten. Wir fanden in der Plasmamembran von aktivierten Thrombocyten einen höheren Gehalt an Stomatin, sodass eine Rolle für Stomatin bei der Wanderung und/oder Fusion der Granula möglich erscheint. Diese Granula enthalten Lipid Rafts, wobei Stomatin eine Hauptkomponente darstellt. Interessanterweise fanden wir einen gravierenden Unterschied bei der subzellulären Lokalisation von Stomatin in polarisierten und nicht-polarisierten epithelialen Zellen. In nicht-polarisierten Zellen war Stomatin hauptsächlich in kernnahen Vesikeln lokalisiert, hingegen war es in polarisierten Zellen fast ausschließlich an der apikalen Membran zu finden. Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, dass diese Stomatin-enthaltenden Vesikel bei der Polarisierung zur apikalen Membran wandern und dass Stomatin dabei und/oder bei der Fusion mit der Plasmamembran eine Rolle spielt. Ein anderer, interessanter Aspekt der Stomatin-Funktion wurde bei der Ca2+-induzierten Vesikulierung von Erythrocyten entdeckt. Nach der Induktion fanden wir, dass die abgeschnürten Mikrovesikel Lipid Rafts enthalten, die stark an Stomatin und dem GPI-verankerten Protein Acetylcholin-Esterase angereichert sind. Dieses Ergebnis zeigt, dass Stomatin eine Rolle bei der Vesikel-Abschnürung und Membranfusion spielen kann. Die Anreicherung von Stomatin ist dabei spezifisch, weil ähnliche Raft-Proteine, wie die Flotilline, nicht in den Vesikeln enthalten sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Stomatin ein Lipid Raft-Protein ist, das in spezifischen Rafts vorkommt. Diese Rafts unterscheiden sich von jenen, die Caveoline und/oder Flottiline enthalten. Mit der Untersuchung dieser verschiedenen Rafts können wir nun einen Beitrag zur allgemeinen Diskussion über den Zusammenbau und die Organisation von Lipid Rafts liefern.