Strukturauflösende Mikroskopie in Ionenkanälen

Die "Molekulare Erkennungs-Kraftmikroskopie" (MRFM) ist eine neue Atomkraftmikroskopie (AFM) - Technik, bei der die spezifische Wechselwirkung (molekulare Erkennung) eines Liganden-Moleküls auf einer AFM - Sonde mit Rezeptoren auf einer Probenoberfläche mit Einzel-Molekül Auflösung studiert wird. Die Immobilisierung von Biomolekülen auf Oberflächen spielt dabei eine wesentliche Rolle bei der Untersuchung von deren Struktur, Dynamik oder molekularer Organisation. Das zu untersuchende Molekül muss derart auf der Probenoberfläche präsentiert werden, dass das Sondenmolekül auf der AFM - Spitze ohne sterische Behinderung binden kann. Eine wegweisende Errungenschaft dazu war das Anbinden eines einzelnen Antikörpers an die AFM Messspitze mittels flexibler Poly(ethylenglykol)800-Kette (PEG800 ). Diese Entwicklung etablierte das AFM als bio-spezifische Detektionstechnik mit Einzel-Molekül Auflösug. Im Rahmen dieses Projektes wurde unter anderem die dafür wichtige Biokonjugationschemie auf der AFM-Spitze einer Diversifizierung und Validierung unterzogen. Eine Vielzahl an heterobifunktionellen PEGs wurde durch Konjugation der N-Hydroxy-succinimid- (NHS), der 2-Pyridyl-dithio- (PDP), einer Maleimid- (Mal), einer Vinylsulfon- (VS), der Nitrilotriessigsäure- (NTA) Gruppe und/oder des Vitamin H (Biotin) synthetisiert, wodurch die kovalente Bindung an Amine und Thiole oder die reversible Bindung an His6-tags und an Avidin ermöglicht wird. Die biotinylierte PEG 800 -Kette repräsentiert eine neue Klasse eines heterobifunktionellen Crosslinkers, da das PEG bereits eine Sonde (Biotin) an ihrem äusseren Ende besitzt. Dieses einfache Messprinzip kann als Modell der "molekularen Erkennungs- Kraftmikroskopie" (MRFM) zur systematischen Untersuchung der physiko-chemischen Eigenschaften unterschiedlich aminofunktionalisierter AFM Spitzen eingesetzt werden. Verschiedene Methoden zur Einführung von Aminogruppen wurden in Hinblick auf ihre Aminogruppendichte und ihre adsorptiven Eigenschaften untersucht. Ausserdem wurde ein neuer Standard zur Quantifizierung von Thiolen mit 4,4`-DTDP, verglichen mit einer überarbeiteten Ellman-Methode, erarbeitet. Diese Thiolbestimmung ist als Qualitätskontrolle bei der Kopplung von thiolaktiven Sondenmolekülen unerlässlich. Für die bio-spezifische Detektion wurden auch unterschiedliche Strategien der Probenfixierung entwickelt. Als eine der biologischen Anwendungen wurde ein Kalziumkanal aus dem Skelettmuskel auf Glimmer gebunden und die Topographie und Bindungseigenschaften eines polyklonalen Antikörpers, sowie die Lokalisierung der Antikörper- Bindungsstellen, mit Hilfe von MRFM untersucht. Weiters wurde ein Monolayer aus Phospholipiden, mit Dithio- gruppen am hydrophoben Ende für die kovalente Bindung an Gold und mit einer Cholin oder einer Biotin-Gruppe am hydrophilen Lipidende, für die spezifische Bindung von Biotin- und His6-markierten Protein verwendt. Verschiedene Studien mit markierten Proteinen zeigten das Potenzial dieses neuen Konzepts für die Anwendung in AFM und Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR). Dieses neue Design ist geeignet für den Aufbau und die Untersuchung von dicht gepackten zweidimensionalen Proteinschichten für die Anwendung in der Biosensorik. Zusammenfassend betrachtet, wurde eine Vielzahl von Biokonjugations-Strategien entwickelt und gezeigt, dass Atomkraftmikroskopie (AFM) eine sehr potente Technik zur Untersuchung der Topographie und bio-spezifischen Funktion biologischer Komponenten unter nativen Bedingungen ist.