Mikrobielle ß-Ketolasen

Ziel des Projektes war es, die von Dagley und Ribbons beschriebene ß-Ketolase des Orcinolabbauweges von Pseudomonas putida ORC sowie andere ß-Ketolasen in ausreichender Menge verfügbar zu machen, um ihr biokatalytisches Potential (e.g. Substrat-, Regio- uns Stereospezifität, Reaktionsumkehr) zu untersuchen. Dies wurde über die Optimierung von Fermentations- und Induktionsbedingungen versucht. Ein weiteres Ziel des Projektes war die Aufklärung des Orcinolabbauweg in Pseudomonas putida ORC auf genetischer Ebene. Um die Organisation des Orcinolabbauweges aufzuklären, wurden aus einer Genbank von Pseudomonas putida ORC - DNA Klone, die Extradioldioxygenase-Aktivität zeigten, isoliert. Zwei verschiedene Extradioldioxygenase- Gene, eine Klasse II und eine Klasse III Dioxygenase wurden isoliert und in E.coli überexprimiert. Durch Vergleich der Proteincharakteristika und der Substratspezifitäten der geklonten Dioxygenasen mit der Orcinol-induzierten Wildtyp-Dioxygenase konnte gezeigt werden, dass die Klasse III Dioxygenase mit der durch Orcinol induzierten Wildtyp-Dioxygenase identisch ist. Diese Dioxygenase ist Teil eines DNA-Abschnittes, der homolog mit dem 3- (3-Hydroxyphenyl)-propionat (HPP) Abbauweg von E.coli K12 ist. Der Orcinol-Pathway konnte somit partiell kloniert und charakterisiert werden. Eine Monooxygenase, eine Dioxygenase und die erste Hydrolase, die in den Orcinol-Abbau involviert sind, wurden auf dem klonierten DNA-Fragment gefunden. Das Gen für das letzte Enzym des Orcinol-Abbauweges, die Acetylpyruvathydrolase befand sich nicht mehr auf dem DNA-Fragment, allerdings konnten über die Natur der Acetylpyruvathydrolase - aufgrund der hohen Homologie mit dem HPP- Pathway - indirekt Schlüsse gezogen werden. Die Klonierung, um diese Schlüsse zu beweisen, ist in Arbeit. Um weiters ein Acetylaceton abbauendes Enzym zu finden, wurde ein Stamm, der das Potential hat, auf Acetylaceton als einziger C-Quelle zu wachsen, isoliert und als Acinetobacter johnsonii (DSMZ ID 98-849) identifiziert. Das Acetylaceton spaltende Enzym dieses Organismus wurde bis zur Homogenität gereinigt und auf biochemischer sowie auf genetischer Ebene charakterisiert. Entgegen unserer Erwartungen, eine hydrolytische Spaltungsreaktion zu finden, spaltet das Enzym Acetylaceton ohne Beteiligung prosthethischer Gruppen mittels Einbau von einem Molekül Sauerstoff zu Acetat und Methylglyoxal. Aufgrund dieser Reaktion wurde die Klassifizierung des Enzyms als Dioxygenase E.C. 1.13.11.-. vorgeschlagen. Weiters wurde das Gen identifiziert, isoliert und in hohen Ausbeuten in E.coli überexprimiert. Die Sequenz der Acetylacetonoxygenase, und des nachfolgenden offenen Leserahmenn ORF2 zeigten keine signifikante Ähnlichkeit mit bekannten Proteinen oder anderen Sequenzdaten. Das Enzym enthält Eisen als Cofaktor. Das Enzym akzeptiert 2,4-Diketone und analoge Strukturen, die ungeladen sind und deprotoniert werden können, nicht aber geladene Substrate. Basierend auf Substratspezifitäten wird ein katalytischer Mechanismus für die Acetylacetonoxygenase vorgeschlagen. Die Enzymstruktur wurde mittels kristallographischen Methoden aufgeklärt (Gudrun Stranzl, C. Kratky Institut für Physikalische Chemie, Karl Franzens Universität Graz). Struktur und Sequenz und katalysierte Reaktion des Enzyms belegen die Neuheit des gefundenen Enzyms, das sich als interessant für industrielle Applikationen herausgestellt hat. Die Resultate aus dem Projekt sind in ein Patent gemündet, das in Zusammenarbeit mit der Firma Biocatalytics, Pasadena, CA (USA), eingereicht wurde. Diese Firma will zum einen das Enzym produzieren und verkaufen und untersucht zum anderen seine mögliche Nutzung in der Produktion von Feinchemikalien, da sich mit dem Enzym neue Synthesewege zur Produktion von a- Oxoaldehyden eröffnen.