Assemblierung von GABAA-Rezeptoren

Die y-Aminobuttersäure (GABA) ist die quantitativ bedeutendste inhibitorische Transmittersubstanz des Zentralnervensystems. Ein Großteil der Wirkungen der GABA wird über GABA A Rezeptoren ausgelöst. GABA A Rezeptoren sind Chloridionen-Kanäle, die durch GABA geöffnet werden können. Viele pharmakologisch und klinisch wichtige Substanzen, wie z.B. Benzodiazepine, Barbiturate, neuroaktive Steroide, Anästhetika und konvulsive Substanzen, üben ihre Wirkung über diese Rezeptoren aus. GABA A Rezeptoren bestehen aus fünf Untereinheiten, die meist drei verschiedenen Untereinheitsklassen (alpha- beta-gamma, alpha-beta-delta, oder alpha-beta-epsilon) angehören. Im Zuge des Projekts P9828-Med gelang es unserer Arbeitsgruppe erstmals, die Zusammensetzung und Anordnung der Untereinheiten eines rekombinanten Rezeptors, bestehend aus der alpha1, beta3 und der gamma2 Untereinheit, aufzuklären (Tretter et al., 1997). Im vorliegenden Projekt sollen diese Arbeiten weitergeführt werden. Ziel des Projektes ist es, diejenigen Aminosäuresequenzen der alpha1, beta3 und gamma2 Untereinheiten zu identifizieren, die für die Bindung der Untereinheiten aneinander und damit für die Assemblierung der Rezeptoren verantwortlich sind. Dazu soll mittels Immunpräzipitation, Westernblot und Dichtegradientenzentrifugation die Ausbildung von (alpha1beta3, alpha1gamma2, oder beta3gamma2 Dimeren in embryonalen Nierenzellen (HEK) untersucht werden, die mit einer kompletten alpha1, beta3, oder gamma2 Untereinheit und einer entsprechenden am C-Terminus verkürzten Untereinheit transfiziert worden waren. Durch weitere C-terminale Verkürzung der Untereinheit soll eine Aminosäuresequenz identifiziert werden, deren Elimination dazu führt, daß die verkürzte Untereinheit nicht mehr an eine komplette Untereinheit binden kann. Diese Studien sollen durch Untersuchung der Bindung zwischen unveränderten und chimären Untereinheiten oder zwischen chimären und C-terminal-verkürzten Untereinheiten komplettiert werden. Schließlich sollen mittels Mutagenese einzelne Aminosäuren identifiziert werden, die für die Bindung der Untereinheiten aneinander hauptsächlich verantwortlich sind. Die Bedeutung dieser Aminosäuren für die Assemblierung der Rezeptoren soll dann an Hand der Fähigkeit von entsprechend mutierten Untereinheiten, intakte Rezeptoren zu bilden, untersucht werden. Die im Zuge dieses Forschungsprojektes erhaltenen Informationen sind für alle weiteren Überlegungen zur Struktur und Funktion von GABA A Rezeptoren von großer Bedeutung und werden zukünftige Untersuchungen bezüglich Zusammensetzung von rekombinanten und nativen GABA A Rezeptor Subtypen und Anordnung ihrer Untereinheiten wesentlich erleichtern.

GABA A -Rezeptoren sind die quantitativ bedeutendsten hemmenden Schaltstellen des Zentral-nervensystems. Sie sind der Angriffspunkt vieler wichtiger Medikamente, wie z. B. der Benzodiazepine, Barbiturate, Steroide, und Anesthetika. GABA A -Rezeptoren sind Chlorid-ionen-Kanäle, die durch die Gamma-Aminobuttersäure (GABA) geöffnet werden können und bestehen aus 5 Protein-Untereinheiten. In diesem Projekt wurden zum ersten Mal Aminosäure-Sequenzen von GABA A -Rezeptor Untereinheiten identifiziert, die vermutlich nicht nur direkte Kontakte zu den Nachbar-Untereinheiten ausbilden, sondern die sich ihre Nachbarn insoferne aussuchen, als sie derartige Kontakte nur mit bestimmten Untereinheiten eingehen. Weiters konnte gezeigt werden, daß jede dieser Untereinheiten des GABA A Rezeptors ähnliche Aminosäure-Sequenzen für derartige Kontakte mit anderen Untereinheiten verwendet, und daß die Untereinheiten auch sehr ähnlich aufgebaut sind. Die Ergebnisse dieses Projektes erklären, wie es zu einer ganz bestimmten Anordnung der Untereinheiten innerhalb eines Rezeptors kommt, und geben wichtige Aufschlüsse darüber, wo bestimmte Aminosäuren lokalisiert sind, die an der Ausbildung von wichtigen pharmakologischen Bindungsstellen dieser Rezeptoren beteiligt sind. Fragestellung: In diesem Projekt sollten Aminosäure-Sequenzen von GABA A -Rezeptor Untereinheiten identifiziert werden, die spezifische Kontakte zwischen den Untereinheiten herstellen und die Zusammenlagerung der Untereinheiten zu kompletten GABA A -Rezeptoren beeinflussen. Diese Information ist für alle weiteren Untersuchungen über die Struktur und Funktion von GABA A -Rezeptoren wichtig und kann direkt bei der Erstellung von Strukturmodellen von GABA A -Rezeptoren und ihrer Bindungsstellen verwendet werden. Ergebnisse: Insgesamt wurden im Zuge dieses Projekts zwei Aminosäure-Sequenzen an der beta3-Untereinheit, und jeweils drei Aminosäuresequenzen an der gamma2-, gamma3-, und alpha1-Untereinheit identifiziert, die für die Bindung an Nachbar-Untereinheiten wichtig sind. Außerdem konnte zum ersten Mal ein direkter Kontakt zwischen einer der identifizierten alpha1- und gamma2-Aminosäuresequenzen nachgewiesen werden. Da sich in einigen dieser Sequenzen Aminosäuren befinden, von denen man weiß, daß sie an der Ausbildung der GABA- oder der Benzodiazepin-Bindungsstelle beteiligt sind, konnten die Sequenzen bestimmten Kontaktstellen zugeordnet werden. Dabei stellte sich heraus, daß unter-schiedliche Untereinheiten ähnliche Aminosäure-Sequenzen zur Ausbildung von Kontakt-stellen mit anderen Untereinheiten verwenden, und daß diese Sequenzen zum Teil sehr selektiv nur mit bestimmten Untereinheiten Kontakte aufnehmen können. Es kann also davon ausgegangen werden, daß derartige selektive Kontakte die Anordnung der Untereinheiten im Rezeptor beeinflussen. Mögliche Anwendungen und Auswirkungen: Arbeiten an diesem Projekt führten zum ersten Mal zu einer Strukturinformation über die direkten Kontaktstellen zwischen den Untereinheiten von GABA A -Rezeptoren. Da sich an diesen Kontaktstellen auch die wichtigsten pharmakologischen Bindungsstellen dieser Rezeptoren befinden, werden diese Informationen direkt in Strukturmodelle dieser Bindungsstellen und Rezeptoren einfließen. Eine genaue Kenntnis der Struktur dieser pharmakologischen Bindungsstellen kann für eine gezielte Entwicklung von spezifischen Medikamenten mit weniger Nebenwirkungen verwendet werden.