Epigenetische Veränderungen an Schwermetall Belastungen

Das vorliegende Projekt beschäftigt sich mit dem Einfluss von Schwermetallen auf zellulärer, molekularer und epigenetischer Ebene im Gemeinen Regenwurm Lumbricus terrestris, um die Beständigkeit und Vererbung von Metall induzierten epigenetischen Veränderungen zu analysieren. Die zentralen Fragestellungen, die das Projekt beantworten wird, sind: Kann die Verschmutzung mit Schwermetallen dauernde bzw. sogar epigenetisch vererbliche Veränderungen im Regenwurm hervorrufen? und Sind die Entgiftung und Toleranz von Metallen durch epigenetische Mechanismen verankert?. Um Entgiftungsprozesse in Regenwürmern zu detektieren, die einer geringen Konzentration von Cd ausgesetzt wurden, wird das Gen zur Metallentgiftung (Metallothionein (MT)) quantifiziert sowie dessen potentielle Regulierung durch epigenetische Mechanismen durch Methylation Sensitive High Resolution Melting (MS-HRM) bestimmt. Der genomweite Methylierungsstatus wird determiniert mit Hilfe von bisulfite-converted restriction site associated DNA sequencing (bsRADseq), eine der modernsten und neuesten Methoden die zur Verfügung stehen. Zusätzlich wird die Expression der in die DNA-Methylierung und -Demethylierung involvierten Gene (DNMT1, DNMT2, DNMT3, TET) gemessen, um Veränderungen im DNA Methylierungsstatus erklären zu können. Die zuvor genannten Analysen werden in Regenwürmern nach einer Exposition mit Cadmium (Cd) bzw. nach einer anschließenden Erholungsphase in Kontrollerde sowie in der F1 und F2 Generation durchgeführt. Des Weiteren, wird mit den zuvor genannten Methoden auch die Entwicklung von Toleranzmechanismen untersucht und zwar in Cd exponierten Regenwürmern sowie deren Nachwuchs. Die Neuheit dieser Studie liegt in der einzigartigen Synergie von Experten unterschiedlicher Disziplinen und auch in der Neuheit der angewandten Methoden die es erlauben, Metall-induzierte epigenetische Veränderungen von verschieden Seiten zu beleuchten. Die Ergebnisse werden neue Information zu epigenetischen Veränderungen und deren Persistenz und Vererbung in Metall kontaminierten Regionen liefern. Das vorliegende Projekt wird auch zum ersten Mal epigenetische Regulierung von Genen zur Metallentgiftung behandeln und dabei Lücken zu Regulierungsmechanismen in Invertebraten füllen.

Das Hauptergebnis dieses Projekts ist eine detaillierte Darstellung der Veränderungen der DNA-Methylierung und deren Zusammenhang mit der Genexpression bei Cadmium (Cd)-inkubierten Regenwurmer Lumbricus terrestris. Die DNA-Methylierung wurde auf genereller, genomweiter und Genus spezifischer Ebene untersucht. Wir konnten zweifelsfrei nachweisen, dass Cadmium eine dosisabhängige generelle DNA-Hypermethylierung im Genom auslöst - und zwar sowohl auf der Ebene der Cytosinmethylierung, als auch erstmals auf der Ebene der Adeninmethylierung. Die an der DNA-Methylierung/Demethylierung beteiligten Gene, einschließlich der Gene DNMT1, DNMT3 und TET, konnten die beobachteten Methylierungseffekte nicht erklären. Auch zeigten weder die Genexpression noch die Proteinaktivität signifikante Veränderungen zwischen den Behandlungsgruppen. Auf der Ebene der Genmethylierung konnten wir geringfügige, jedoch nicht signifikante Veränderungen der Intron- und Exonmethylierung des Metallothionein (MT2)-Gens beobachten, wobei diese Veränderungen in keinem Zusammenhang mit der MT2-Genexpression stehen. Darüber hinaus haben wir mithilfe von Next-Generation-Sequenzierungstools ein hochauflösendes Bild der genomweiten Methylierungsveränderungen auf Nukleotidniveau erstellt. Die globale Hypermethylierung spiegelte sich dabei nicht im gesamten Genom wider. Hochdurchsatzsequenzierungen zeigten vielmehr eher eine dosisabhängige Cd-induzierte DNA-Hypomethylierung auf genomweiter Ebene. Die meisten Methylierungsänderungen traten dabei innerhalb von Genkörpern auf. Interessanterweise waren bei einer höheren Cd-Behandlung differenziell methylierte Regionen mit einer Gruppe von "Metallionen-Stressantwort"-Genen assoziiert. Dies deutet klar auf einen epigenetischen Hintergrund hin, der die Reaktion des Organismus auf die Cd-Behandlung steuert. Die Transkriptomanalyse hat gezeigt, dass bestimmte Gene differentiell exprimiert werden. Diese Gene sind wiederum an DNA-Schäden und -Integrität, oxidativem Stress und Metall-Stressreaktionen beteiligt. Des Weiteren zeigten Gene, die am Stoffwechsel, an Bindungs- und Katalyseaktivitäten beteiligt sind, die stärksten Veränderungen durch die Cadmiumbehandlung. Der in dieser Studie verwendete Multi-OMICS-Ansatz, der epigenetische und transkriptomische Endpunkte kombiniert, liefert wertvolle und hochauflösende Daten über die Reaktionen von Organismen auf Schwermetallstress. Dieser Ansatz ist von großem Wert und sollte viel häufiger angewendet werden, sowohl in der Umwelt-Epigenetik als auch in der Grundlagenforschung im Bereich Epigenomik und in der angewandten Ökotoxikologie. Er ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung epigenetischer Biomarker.