Conformations of EAAT3 Measured by Transition Metal Ion FRET

Der sekundär-aktive Glutamat-Transporter "EAAT3" ("excitatory amino acid transporter 3") ist für das ordnungsgemäße Funktionieren neuronaler Funktionen essentiell. Schädigungen der normalen Funktion und Expression von EAAT3 haben schwerwiegende Konsequenzen zur Folge wie z.B: Epilepsie, Schlaganfall, amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Morbus Alzheimer. EAAT3 wurde aufgrund seiner klinischen Bedeutung auch ausgiebig untersucht; jedoch sind immer noch wesentliche Teile des Transportzyklus ungeklärt. Speziell das molekulare Detail des Translokationsschrittes und die Bindungsstelle des Kaliumions bleiben bis dato ungeklärt. Wir wollen mit Hilfe von Übergangsmetall-Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer-Analyse (TM-FRET) die Bindung an und die Translokation von Kalium durch den EAAT3 messen. In Verbindung mit diesem experimentellen Ansatz werden wir traditionelle elektrophysiologische Methoden verwenden, z.B. die "whole cell patch clamp" Technik, daneben noch "molecular modelling" und spezielle computergestützte Auswertemethoden, die alle vorgeschlagenen Messungen integrieren. "Whole cell patch clamp" Messungen erlauben die Erhebung von Informationen bezüglich Ladungsverschiebungen und mit TM- FRET können wir kleinste räumliche Veränderungen innerhalb der Transmembran-Helices von EAAT3 feststellen. Zusammengenommen werden uns diese Daten Rückschlüsse über die Kaliumbindungsstelle sowie die Unterscheidung dieser Kaliumbindungsstelle von den Natriumbindungstellen 1und 3 erlauben. Die kombinierte Anwendung dieser Techniken sollte auch zu einer detaillierten Beschreibung der Bindungsstellen dieser Ionen sowie der globalen Bewegungen von EAAT3 führen, besonders denjenigen in Zusammenhang mit Kalium. Erfolgreiche Anwendung dieser kombinierten Techniken könnte die Entwicklung von neuen Therapeutika zur Folge haben insbesondere könnte TM-FRET auch die zukünftige Forschung im Gebiet der Transmembran-Transporter stimulieren. Die geplanten Experimente werden an der Medizinische Universität Wien im Zentrum für Physiologie und Pharmakologie gemeinsam mit Harald Sitte und Thomas Stockner durchgeführt. Die Medizinische Universität Wien hat einen hervorragenden Ruf auf dem Gebiet der Transmembran-Transporter und Harald Sitte gilt als Pionier auf dem Gebiet der Anwendung von fluoreszenzspektroskopischen Methoden bei diesen Proteinen. Die internationale Antragstellerin, Catherine B. Zander, beherrscht alle genannten funktionellen Methoden aufgrund ihrer Ausbildung im Labor von Christof Grewer, dessen Labor für grundlegende Arbeiten auf dem Gebiet der EAATs und anderer neurologisch bedeutsamer sekundär- aktiver Transporter bekannt ist.