S-Schicht (Glykosylierung) für Tannerella Biofilmbildung

Die Untersuchung von Pathogenitätsmechanismen von oralen Bakterien wie den Parodontoseerregern Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis und Treponema denticola ist von biomedizinischer Relevanz. Voraussetzung für die Entstehung von Parodontose ist ein bakterieller Biofilm. Daher ist das detaillierte Verständnis der Biofilmbildung, sowohl von Monospezies- als auch von Multispezies-Biofilmen, entscheidend für die Entwicklung von Strategien, um gezielt in diesen Prozess einzugreifen. Dadurch könnte das Fortschreiten einer Infektion und folglich die Entstehung von Parodontose verhindert werden. Das anaerobe, parodontal-pathogene Bakterium T. forsythia ist Gegenstand dieses Projekts; es ist ein "später Besiedler" des Multispezies-Plaque-Biofilms in den Zahntaschen. Untersuchungen am Gastinstitut haben gezeigt, dass T. forsythia eine einzigartige Zellhülle besitzt. Diese ist aus zwei ko-assemblierenden und 2D- kristallisierenden S-Schichtproteinen aufgebaut und mehrfach mit einem ungewöhnlichen Oligosaccharid modifiziert. Diese Eigenschaft ist insofern interessant als speziell Zelloberflächenstukturen die Ausbildung und/oder Architektur von Biofilmen beeinflussen können. Der Umstand, dass die S-Schichtproteine und ein mögliches Exportsystem unter Biofilmbedingungen hochreguliert sind unterstützt diese Annahme. Erste Daten zeigen, dass das TfsB S-Schichtprotein die Aggregation von T. forsythia Zellen unterbindet, während die Oberflächenadhäsion der Zellen verstärkt ist; außerdem zeigt eine Mutante mit einem verkürzten und ungeladenen S-Schichtglykan, eine effizientere Biofilmbildung. Dies lässt auf einen distinkten Regulationsmechanismus von S- Schichtbildung, Glykosylierung und Biofilmbildung schließen. Es soll hier eine detaillierte, mechanistische Untersuchung des Einflusses der Zelloberflächen-strukturen von T. forsythia auf die Biofilmbildung erfolgen. Unsere Hypothese besagt, dass die S-Schicht von T. forsythia und ihr Glykosylierungsgrad als unmittelbare Kontaktzone des Bakteriums mit seiner Umgebung die intra- und inter- Spezieskommunikation in der Mundhöhle beeinflusst. Diese ist Voraussetzung für die Biofilmbildung, die Adhäsionsfähigkeit des Bakteriums und, demzufolge, für eine Infektion. Das biochemische und molekulare Verständnis des Zusammenhangs zwischen Zelloberflächeneingenschaften/strukturen und Biofilmbildung kann dazu beitragen, die Rolle von T. forsythia bei der Entstehung von Parodontose besser zu verstehen. Konkrete Ziele diese Projekts sind: 1) Bestimmung von optimalen Bedingungen für Biofilmbildung von T. forsythia Wildtyp- Zellen unter Testung verschiedener Substrate und Umweltfaktoren; 2) Untersuchung des Einflusses der S-Schicht und des Glykosylierungsgrades auf die Biofilmbildung mit Fokus auf die initiale Anheftung; 3) Analyse der Auswirkung der Zelloberflächeneigenschaften von T. forsythia auf die Ausbildung von Multispezies-Biofilmen. T. forsythia S-Schicht- und Glykosylierungsmutanten (mit Fokus auf die modifizierte Pseudaminsäure als bekanntes Adhäsin von pathogenen Bakterien, und auf N Acetylman-nosaminuronsäuren, da beide einen Ladungsbeitrag leisten) sowie rekombinante S Schichtproteine und das S-Schichtglykan sind verfügbar.

Tannerella forsythia (Tf) ist ein orales Pathogen, das zusammen mit Porphyromonas gingivalis und Treponema denticola den sogenannten roten Komplex bildet und nachweislich mit Parodontose in Verbindung steht. Das Leben im Biofilm bietet Organismen, insbesondere Krankheitserregern, mehrere Überlebensvorteile und wird deswegen von Mikroorganismen bevorzugt gewählt. Innerhalb eines natürlichen Biofilms befinden sich meist mehrere Spezies, die miteinander interagieren können (Synergien oder Antibiosen). Außerdem sind die Zellen des Biofilms in der Matrix eingebettet, einer selbstproduzierten schleimartigen Subs- tanz, die den Zellen Schutz gegenüber Umwelteinflüssen bietet. Im Fall von pathogenen Mikroorganismen wurde beispielsweise gezeigt, dass die Matrix hilft, der Immunantwort des Wirts zu entkommen oder toxische Substanzen wie Antibiotika nur erschwerten Zugang zu den Zellen haben. Das sind nur einige Beispiele, die verdeutlichen, dass die Biofilm-Bildung bei der Entwicklung von Medikamenten berücksichtigt werden muss. Für die Entstehung von Mono- und Multispezies-Biofilmen ist die Oberfläche des Mikroorganismus als direkte Kontaktzone zur Umwelt besonders wichtig. Das macht Tf zu einem interessanten Forschungsobjekt, da Tf eine bisher einzigartige Oberfläche besitzt. Tf ist Gram-negativ, mit einer zusätzlich aufgelagerten Proteinschicht, der S-Schicht. Die S-Schicht besteht aus zwei O-glykosylierten Proteinen, TfsA und TfsB. In unserem Labor liegen Einzel- und Doppel-S-Schicht Mutanten, sowie auch die Glykosylierungs-Mutante ?wecC vor, der drei geladene Zucker des O-Glykans fehlen. Dies ermöglicht uns eine vergleichende Analyse, um den Einfluss der S- Schicht und ihres Glykosilierungs-Status auf die Biofilm-Formation zu ermitteln. Andere Studien konnten zeigen, dass Tf kaum bis keinen Biofilm bildet und im Verglich dazu die?wecC Mutante erhöhte Biofilmbildung zeigt. Interessanterweise wurde in dieser Studie auch gezeigt, dass die ?wecC Mutante hydrophob ist. Dies konnte von uns nicht bestätigt werden. Nach Optimierung der Bedingungen konnten wir sowohl für den Wildtyp, als auch für die?wecC Mutante eine verbesserte Effizienz der Biofilm-Bildung beobachten. Dies war von zentraler Bedeutung für unsere Forschung, da eine genaue Analyse der Biofilm-Formation ein gewisses Maß an Effizienz voraussetzt, um insbesondere schlechtere Biofilm-Formation zu beobachten. Die genaue Charakterisierung der ?wecC Mutante ergab, dass die Zellen hydrophil sind und eine höhere Benetzbarkeit aufweisen. Sie autoaggregieren verstärkt und zeigen daher eine verbesserte Biofilm-Bildung. Die S-Schicht Mutanten führen zu einem Phänotyp, der seine Aggregationsfähigkeit verliert, aber eine erhöhte Affinität zu verschiedenen Substraten aufweist. Dies führt dann zu einem teppichartigen Biofilm, der aus zwei bis drei Zelllagen besteht und fast vollständig die Fähigkeit verliert, dreidimensionale Strukturen oder Zellcluster zu bilden.