Beitrag von Eisen zum programmierten Zelltod bei Pflanzen

Zielsetzungen des Projekts: Erforschung der katalytischen Rolle von Eisen bei induzierten programmierten Zelltod in Protoplastenkulturen in verschieden Kopexbindungen mit Pflanzenmetaboliten Eisen ist ein essentieller Bestandteil aller Lebensformen, aber gleichzeitig auch potentiell toxisch. In Zellen katalysiert Fe2+ die Fenton Reaktion, die Bildung von Hydroxylradikalen, in Gegenwart von Superoxidanionradikalen oder Wasserstoffperoxid. Hydroxylradikale oxidieren das nächstbeste Biomolekül und können auch den programmierten Zelltod auslösen. Phenolische Sekundärstoffe, wie z.B. Juglon, ()-Catechin oder 8-Hydroxychinolin, komplexieren Eisen als kompetitive Liganden. Diese Substanzen sind mehr oder weniger phytotoxisch und induzieren auch programmierten Zelltod in verschiedenem Ausmaß. Im Gegensatz dazu ist das Pflanzenhormon Salicylsäure nicht phytotoxisch, obwohl es auch eine phenolische Substanz ist, die Eisen komplexieren kann. In lebenden Zellen hängt die Verfügbarkeit von Eisen von der Qualität entsprechender organischer Liganden ab, die es komplexieren. Dabei kommen als niedermolekulare Liganden Zitronensäure, eine Metabolit des Krebszyklus, und Nikotianamin in Frage. In der Annahme, dass eine zelltodinduzierende Wirkung dieser Substanzen auf die effiziente Autoxidation von Eisen (II) im Komplex mit den Testsubtanzen zurückzuführen ist, erwarten wir bei Juglon eine stärkere Wirkung als bei ()-Catechin. 8-Hydroxychinolin ist nicht, wie die beiden anderen genannten Substanzen, redoxaktiv, sondern gilt als extrem kompetitiver Eisenchelator. Diese drei Sekundärmetaboliten wurden gründlich hinsichtlich ihrer anti- und pro-oxidativen Eigenschaften charakterisiert. Die Zielsetzung des vorliegenden Projekts ist, den aufgrund der aus dem chemischen Assay vorliegenden Einsichten postulierten Wirkmechanismus in lebenden Zellen zu erforschen. Ihre Aktivitäten werden mit einem Pflanzenhormon ähnlich Struktur, Salizylsäure, und den beiden natürlich vorkommenden Liganden Zitronensäure und Nikotianamin verglichen werden. Darüber hinaus werden noch mehrere in der Medizin eingesetzte Eisenchelatoren getestet. Demgegenüber stellt der Eisenkomplex mit Ethyeldiamintetraessigsäure (EDTA) eine Kontrolle für Eisenkomplex dar, der ein effizienter Katalysator für die Fenton Reaktion ist. Dies soll in Protoplastenzellkulturen, die von Blättern der Speiserübe (Brassica rapa) hergestellt werden, erfolgen. Die Kultur der Protoplasten erfolgt auf Murashige-Skoog Medium. Die Protoplastenkulturen sollen dann einerseits mit den Testsubstanzen, in freier Form und mit komplexiertem Eisen behandelt werden. Unter anderem sollen verschieden mikroskopische und biochemische Assays zur Charakterisierung der physiologischen Vorgänge, die zum Zelltod führen, eingesetzt werden: Evans Blau und Fluorescein Diacetat/Propidium Iodid für Zelltodreaktionen, Malonyldialdehyd, ein Reaktionsprodukt der Fettsäureperoxidation als Index für oxidativen Schaden, das Verhältnis von Ascorbinsäure zu Dehydroascorbinsäure als Hinweis auf Veränderungen in der Redox Homöostase sowie DAPI Färbungen, DNAse Aktivität und DNA Laddering für die Detektion von DNA- Doppelstrangbrüchen.

Eisen ist ein für alle Lebensformen essentieller Nährstoff. Eisen ist jedoch in Überkonzentration auch potenziell toxisch. In der Zelle katalysiert FeII im Beisein von Superoxid- oder Hydroylionen die Fentonreaktion. Aufgrund dessen kommt es zur Oxydation von Biomolekülen durch Hydroxylradikale, was wiederum den programmierten Zelltod (Apoptosis) mit verursacht. Phenolische Sekundärmetaboliten mit freien Elektronenpaare von Stickstoff und Sauerstoff, wie etwa Juglon, ()-Catechin oder 8-Hydroxychinolin stellen kompetitive Eisenliganden dar, welche ihrerseits zur Apoptose beitragen können. Das Ziel des gegenständlichen Projektes war die Erforschung der Wirkmechanismen dieser Substanzen welche durch gängige Versuche zum Zelltod vermutet wurden. Die Wirkung dieser allelopathisch wirksamen Substanzen sollte mit natürlich vorkommenden Eisenliganden und Zitronensäure verglichen werden. Ein EDTA-Fe (ethylenediaminetetraacetic acid) Komplex wurde als effizienter Fenton- Katalysator verwendet. Unter der Annahme, dass die Autooxydation zweiwertigen Eisens Apoptose induzierte, wurde vermutet und bewiesen dass Juglon von den verwendeten Reagenzien am effizientesten zur Apoptose beitrug. In der Tat stellte sich Fe-Juglon als besonders toxische Hemmsubstanz für pflanzliches Wachstum heraus, da die mit 10 M Fe-Juglon in der Nährlösung behandelten Pflanzen rasch welkten und abstarben. Bei geringerer Konzentration von 2-5 M wurde eine bessere Eisenversorgung beobachtet als im Vergleich mit 10:10 M Fe als in Komplexen mit Salicylsäure, Hydroxychinolin oder ()-Catechin, und das Pflanzenwachstum wurde nicht behindert. Diese weist darauf hin dass Juglon in geringeren Konzentrationen (hormetisch) förderlich ist und erst bei höheren Konzentrationen Toxizität auftritt. Der Zusatz von Eisenkomplexen mit ()-Catechin, 8-Hydroxychinolin oder Salicylsäure (10:10 M) führte zu intercostalen Chlorosen genau wie be Eisenmangel. Derart behandelte Pflanzen zeigten auch nicht autolytischen programmierten Zelltod wie bei Fe-Mangel, was sich durch erhöhte Konzentrationen von ROS, erhöhte DNase, alkaline Protease und Caspase-3 ähnlichen Aktivität in den betroffenen Blättern von Brassica napus aüßerte. Protoplasten welche aus den jungen Blättern dieser Pflanzen gewonnen wurden ließen Kernkondensation erkennen. Diese Befunde wurde weiterhin gestützt durch erhöhte Fe-chelat Reduktase in den Wurzeln, niedrigere Catalaseaktivität (ein Schlüsselindikator für physiologische Eisengehalte in Pflanzen) und erniedrigte Konzentration von Chlorophyll und Carotinoiden in Blättern. Fe-citrat. Fe-EDTA and Fe-deferoxamin (10:10 M) gewährleisteten eine gute Eisenversorgung der Pflanzen und verursachten keine pathologischen Effekte. Fe im Komplex mit aromatisch- phenolischen Liganden wie Salicylat, 8-Hydroxichinolin und ()-Catechin setzen keine ausreichenden Fe Konzentrationen für funktionellen pflanzlichen Stoffwechsel frei. Deshalb kam es zu Fe-Mangel analogen Auswirkungen und in Folge zum beschleunigten programmierten Zelltod, und zwar aufgrund der damit in ursächlichem Zusammenhang stehenden Überproduktion und Anhäufung von ROS in den Zellen.