Die Komplexität von Komplexen in der Stomataentwicklung

Die meisten Landpflanzen haben kleine Poren, genannt Stomata oder Spaltöffnungen in ihrer Blattoberfläche durch die sie CO2 aus der Luft für die Photosynthese aufnehmen. Die Entwicklung dieser lebensnotwenigen Strukturen folgt einem speziellen Muster und wird von drei einander ähnelnden Transkriptionsfaktoren (Proteinen die die Aktivität von Genen in der DNA regulieren) gesteuert. Diese Transkriptionsfaktoren aktivieren unterschiedliche Gene in je einer bestimmten Entwicklungsphase. Wie, ist jedoch unklar da aufgrund ihrer Ähnlichkeit anzunehmen ist, dass sie an dieselben DNA-Sequenzen binden. Dieses Problem betrifft viele Transkriptionsfaktoren, da diese oft zu größeren Proteinfamilien gehören die Mitglieder mit sehr ähnlichen Eigenschaften haben. Eine mögliche Antwort liegt in den Proteinen die mit den Transkriptionsfaktoren interagieren um Proteinkomplexe zu bilden und entscheidend sein können für ihre DNA Bindung und Aktivität. Eine andere Möglichkeit sind posttranslationale Modifikationen, kleine, veränderliche Anhängsel wie Phosphor Moleküle oder winzige Modifikatorproteine. Stomata eignen sich gut, um dieser Frage nachzugehen, da bereits kleine Änderungen in der Funktion der beteiligten Transkriptionsfaktoren zu sichtbaren Veränderungen in ihrer Entwicklung führen und es deshalb einfach ist die generelle Rolle eines Proteins in der Stomataentwicklung festzustellen. Ziel dieses Projektes ist es daher, die Proteine die mit den Schlüsseltranskriptionsfaktoren der Stomataentwicklung interagieren zu vergleichen und ihre posttranslationalen Modifikationen zu identifizieren, um die Ursache für ihre unterschiedliche Funktion festzustellen. Dazu werden Protein die mit den Transkriptionsfaktoren interagieren aus jungen Blättern isoliert, entweder indem ganze Proteinkomplexe herausgezogen werden oder indem Proteine die sich in der Nähe der Transkriptionsfaktoren befinden markiert und danach isoliert werden. Die Proteine werden dann mittels Massenspektrometrie identifiziert und auf Interaktion mit allen drei Transkriptionsfaktoren getestet. Posttranslationale Modifikationen werden mithilfe von Antikörpern identifiziert. Für die interessantesten Proteine und Modifikationen wird ihre Bedeutung für die Stomataentwicklung festgestellt, indem Mutanten auf Stomatadefekte überprüft werden, und die Bedeutung für DNA Bindung, Aktivität und Stabilität der Transkriptionsfaktoren getestet. Dadurch sollen neue Einblicke in die molekularen Grundlagen der Stomataentwicklung gewonnen werden, die auch für die Forschung an der Funktion von Stomata nützlich sein können. Da die Entwicklung von Stomata in zwei- und einkeimblättrigen Pflanzen unterschiedlich ist, wird in dieser Studie je ein Vertreter dieser großen Gruppen untersucht um die evolutionären Unterschiede in der Regulierung ihrer Stomataenwickung besser zu verstehen: Arabidopsis thaliana für Zwei- und Brachypodium distachyon für Einkeimblättrige.

In diesem Projekt wurden neue Regulatoren für die Entwicklung von spezialisierten Blattzellen, sogenannten Stomata, identifiziert und eine neue, Methode zur Identifizierung von Proteinen und lokaler Proteinzusammensetzung in Pflanzen etabliert. Stomata, oder Spaltöffnungen, sind kleine Poren in der Blattoberfläche durch die Kohlendioxid für die Photosynthese aus der Luft aufgenommen wird. Die Entwicklung dieser lebensnotwenigen Strukturen folgt einem speziellen Muster und wird von drei einander ähnelnden Transkriptionsfaktoren (Proteinen die die Aktivität von Genen in der DNA regulieren) gesteuert. Diese aktivieren unterschiedliche Gene in je einer bestimmten Entwicklungsphase. Wie, ist eine große Frage, da aufgrund ihrer Ähnlichkeit anzunehmen ist, dass sie - wie häufig in großen Transkriptionsfaktorfamilien - an dieselben DNA- Sequenzen binden. Eine Möglichkeit ist, dass andere Proteine mit den Transkriptionsfaktoren interagieren um Proteinkomplexe zu bilden und somit ihre DANN- Bindung und Aktivität beeinflussen. Um das zu überprüfen, wurden solche Proteine aus je einem Vertreter von Zwei- (Arabidopsis thaliana) und Einkeimblättrigen (Brachypodium distachyon) Pflanzen isoliert und verglichen. Wie vermutet, wurden sowohl gemeinsame wie auch unterschiedliche Interaktionspartner für die drei Transkriptionsfaktoren gefunden. Diese umfassen andere Transkriptionsfaktoren - auch solche die Dimere mit unterschiedlicher DNA Präferenz bilden könnten - und Koregulatoren, die die DNA Struktur verändern um kurz- oder langfristige Änderungen in der Aktivität von Genen zu bewirken. Andere Proteine könnten die Stabilität oder Aktivität der Transkriptionsfaktorkomplexe beeinflussen. Zwischen Proteinen die aus Arabidopsis und Brachypodium isoliert wurden gibt es Ähnlichkeiten die darauf hindeuten, dass Teile der Regulationsmaschinerie konserviert sind, sowie Unterschiede die mit Eigenheiten in der Entwicklung und Verteilung der Stomata am Blatt in der jeweiligen Pflanzenspezies korrelieren. Weiterführende Analyse von neu gefundenen Regulatoren der Stomataentwicklung wird zu unserem Verständnis dieses Prozesses beitragen. Ein großer Erfolg dieses Projekts, der der Pflanzenforschung im Allgemeinen zugutekommt, ist die Adaptierung einer effizienten proximity labeling Methode mit dem Enzym TurboID, das für die Forschung in Tiersystemen entwickelt wurde. TurboID befestigt einen kleinen molekularen Marker an Proteinen die sich in seiner Nähe befinden, der dann dazu verwendet werden kann um diese zu isolieren. Im Zuge dieses Projektes wurden mit dieser Methode Proteinkomplexe von einem der Transkriptionsfaktoren in der Stomataentwicklung und Proteine im Zellkern von jungen Stomata isoliert. Die Möglichkeiten die diese Methode bietet sind vielseitig und nicht auf diese Anwendungen beschränkt. Die Etablierung von TurboID für die Pflanzenforschung legt daher die Grundlage für zukünftige proximity labeling Experimente und wird einen großen Einfluss auf unterschiedlichste Gebiete der Pflanzenforschung haben.