Strukturelle und funktionelle Analyse von Glutamatrezeptoren

Ionotrope Glutamat Rezeptoren (iGluRs) sind Liganden-abhängige Ionenkanäle, welche die Mehrheit der anregenden Impulse in Säugergehirnen weiterleiten. Dadurch spielen iGluRs in beinahe allen Funktionen des Nervensystems, wie etwa in der Entwicklung, beim Lernen, bei der Gedächtnisbildung und der Homöostase eine wesentliche Rolle. Im Gegensatz dazu sind dysfunktionale iGluRs mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson, psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie und Depression und akuten Erscheinungen wie Schlaganfall und Epilepsie assoziiert. Die Familie der iGluRs ist in drei Subfamilien unterteilt, AMPA-, Kainat- und NMDA- Rezeptoren. Obwohl sich diese Unterfamilien in ihren pharmakologischen und kinetischen Eigenschaften unterscheiden, teilen sie denselben strukturellen Aufbau. iGluRs bestehen aus vier Untereinheiten, die jeweils aus einer großen extrazellulären Amino-terminalen Domäne (ATD), welche für die Subfamilienspezifische Rezeptorassemblierung, den Transport und die Regulierung verantwortlich ist, eine Ligandenbindungsdomäne (LBD), die Agonisten oder Antagonisten bindet, der Ionenkanal-bildenden Transmembrandomäne (TMD) und eine Carboxyl-terminalen Domäne (CTD) welche für die synaptische Lokalisierung, die Rezeptormobilität und Regulierung wichtig ist, bestehen. Sobald Glutamat in den synaptischen Spalt freigesetzt wird bindet es an die LBD der postsynaptischen iGluRs. Im Folgenden durchläuft der Rezeptor eine Vielzahl von Umlagerungen welche zuerst zum Öffnen des Kanals und innerhalb von Millisekunden zur Desensibilisierung des Rezeptors führt. Obwohl bereits zahlreiche strukturelle Analysen von isolierten LBDs und Volllängen Rezeptoren im Ruhezustand veröffentlicht wurden, fehlen uns speziell im physiologisch relevanten tetrameren Kontext, detaillierte Informationen des aktiven und des desensibilisierten Zustandes. Dieser Forschungsantrag setzt sich als erstes Ziel diese wesentlichen Informationen zu erarbeiten und dadurch ein umfassendes Bild der ionotropen Glutamatrezeptor Aktivierung zeichnen zu können. Hierfür werden wir an bestimmten Stellen in der LBD Cystein- oder Histidin-Mutationen einbauen, um unterschiedliche Aktivierungszustände für die Kristallisation zu trappen. In einem zweiten Schritt werden unsere Hypothesen und die physiologische Bedeutung dieser Trapping-Mutationen in elektrophysiologische Experimenten überprüft. Die Ergebnisse dieser Studie werden die nötigen Informationen über die LBD Bewegung während der Rezeptoraktivierung liefern und unser Verständnis darüber verbessern. Jüngste Studien an NMDA Rezeptoren zeigen, dass ATDs die Rezeptoraktivität modulieren können. Allerdings ist der molekulare Mechanismus dahinter bisher unbekannt. Ebenso ist unklar ob ATDs eine regulatorische Funktion in AMPA- und Kainat- Rezeptoren haben. Erste unveröffentlichte Daten des Gastgeber-Labors bestätigen eine regulatorische Rolle der ATDs in AMPA Rezeptoren. Als zweites Ziel dieses Antrages wird diese Rezeptorregulierung durch ATDs weiter untersucht wobei ein ähnlichen Trapping-Ansatz wie im ersten Ziel zum Einsatz kommt um die ATDs sowohl strukturell als auch funktionell zu charakterisieren. Die Untersuchung der ATDs ist unerlässlich um zu verstehen, ob ein Ligand der an die ATD binden kann auch in der Lage ist die Rezeptoraktivität zu beeinflusse. Die Ergebnisse des gesamten Forschungsvorhabens werden unser Wissen über Glutamat Rezeptor Aktivierung und Modulierung sowohl bei normaler Gehirnfunktion als auch bei Krankheiten essentiell erweitern.

Gehirnfunktionen wie Gedächtnisbildung, Kognition und Lernen beruhen auf einer geordnetetn Kommunikation von Nervenzellen durch Synapsen. Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ (AMPARs) befinden sich an der postsynaptischen Stelle, wo sie, nach der Bindung des Neurotransmitters Glutamat, ihren Ionenkanal öffnen. Dabei vermitteln AMPARs den Großteil der anregenden Signalübertragung im Gehirn von Säugetieren. Veränderte AMPARs sind mit neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie, Schizophrenie und Alzheimer assoziiert. Dieses Projekt zielte darauf ab, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die der Rezeptoraktivierung und -modulation durch Hilfseinheiten, sogenannten TARP-Proteine, zugrunde liegen. In einem ersten Ansatz verfolgten wir in funktionellen Experimenten die Bewegung des Rezeptors vom Ruhezustand (kein Ligand gebunden und geschlossene Pore) zum Glutamat-gebundenen aktiven Zustand (Pore offen) bis hin zum desensibilisierten Zustand (Glutamat ist noch gebunden, aber die Pore ist bereits geschlossen). Dafür wurde der Rezeptor, mit Hilfe von redoxsensitiven oder metallfangende Mutationen, in seinen verschiedenen Aktivierungszuständen eingefangen. In Kombination mit Strukturstudien mittels Röntgenkristallographie, fanden wir heraus, dass die Ligandenbindungsdomänenebene der Rezeptoren hochdynamisch ist. Ausschließlich das Binden von Agonisten wie Glutamat, konnte die Rezeptorebene der Ligandenbindungsdomäne ausreichend stabilisier, um eine Öffnung des Ionenkanals zu ermöglichen. In einem zweiten Ansatz untersuchten wir die modulatorische Rolle von TARPs auf die Rezeptorkinetik. In früheren Studien wurde gezeigt, dass TARPs direkt mit AMPA-Rezeptoren assoziieren und dadurch ihre Öffnungszeiten und Desensibilisierungsraten beeinflussen. Die genauen Regionen, die für diese Rezeptormodulationen verantwortlich sind, waren jedoch nicht bekannt. Mithilfe von In-Silico-Strukturmodellen wurden diejenigen Abschnitte vorhergesagt, die für die modulatorischen Eigenschaften verantwortlich sein könnten. Diese Hypothesen wurden in elektrophysiologischen Experimenten überprüft. Dadurch konnte erstmals gezeigt werden, dass TARPs an einer Rezeptorstelle wechselwirken, die das Signal des Ligandenbindungsereignisses zur Pore weiterleitet. Die Ergebnisse dieses Projekts trugen wesentlich zu unserem Verständnis der Aktivierung und Modulation von AMPAR-Rezeptoren bei und zeigten mögliche Wege auf, die AMPAR-Signalübertragung in Krankheitsmodellen zu beeinflussen. Im Idealfall könnten unsere Ergebnisse zukünftige Ansätze zur Arzneimittelentwicklung inspirieren.