Strukturelle Analyse des Intraflagellaren Transports

Zilien/Flagellen sind komplexe Stukturelemente, die auf der Oberfläche vieler eukaryotischer Zellen zu finden sind. Sie bestehen aus einem aus Mikrotubuli bestehenden Axonem, welches auf einem von einer Zentriole abgeleiteten Basalkörper aufgebaut wird, und sind von der ziliären Membran umgeben. Diese Strukturen erfüllen viele Aufgaben, zum Beispiel zelluläre Fortbewegung (wie etwa in Protozoen und bei Spermien), Signalaufnahme (wie bei den Stäbchen und Zäpfchen in der Retina des Auges), oder zum Transport von Flüssigkeiten oder Partikeln über die Zelloberfläche (wie im Eileiter oder in den Bronchien). Fehlerhafter Aufbau bzw. totaler Verlust von Zilien ist mit einer großen Anzahl humaner Krankheiten verknüpft, die man generell als `Ziliopathien` bezeichnet, und führt zu phenotypischen Ausprägungen wie Blindheit, Taubheit, Sterilität und Zystenbildung, aber auch zu schweren Entwicklungsstörungen beim Embryo. Diese Entwicklungsabnormalitäten wurden vor kurzem damit in Zusammenhang gebracht, daß Zilien eine wichtige Rolle bei verschiedenen Signaltransduktionswegen (wie etwa Wnt und Shh) spielen, und zwar vor allem durch ziliäre Lokalisation wichtiger Rezeptoren und intrazellulärer Signalproteine. Ein zentraler Prozess beim Aufbau von Zilien ist der Intraflagellare Transport (IFT), der Bausteine vom Zellkörper zur Zilienspitze transportiert (anterograder Transport) und Abbauprodukte zurück zum Zellkörper bringt (retrograder Transport). Dieser Mechanismus ist zwischen Einzellern (wie zum Beispiel der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii) und komplexen multizellulären Organismen (wie dem Menschen) hoch konserviert. Die Hauptplattform für diesen Prozess ist der IFT Komplex, der aus etwa 20 Proteinen besteht und in zwei Sub- Komplexe unterteilt werden kann. Dieser IFT Komplex ist sowohl für die Bindung von Cargomolekülen als auch von den Motorproteinen verantwortlich, die die Kraft für die Bewegung bereitstellen. Seit der Entdeckung daß Zilien eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion spielen wurde viel Arbeit in die biochemische Charakterisierung des IFT Komplexes investiert. Trotzdem ist unser Wissen über den IFT Prozess sehr lückenhaft, vor allem bezüglich der Architektur des IFT Komplexes und bezüglich der Regulation der diversen Zwischenschritte in diesem Prozess. Vor allem hinsichtlich der dreidimensionalen Strukturen von IFT Proteinen ist bis auf die Ausnahme des humanen IFT25 Faktors nichts bekannt. Eine genaue Analyse der Stukturen dieser Proteine und von größeren Sub-Komplexen ist definitiv wichtig für unser Verständnis des IFT Mechanismus. Das hier vorgeschlagene Projekt hat eine genauere strukturelle Analyse des IFT Komplexes zum Ziel. Rekombinante IFT Proteine und Sub-Komplexe des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii werden für die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur verwendet. Des weiteren werden individuelle Proteininteraktionen zwischen einzelnen Faktoren durch systematische `pulldown`-Experimente festgestellt und die daran beteiligten Proteindomänen identifiziert, um unser Verständnis der generellen Architektur des IFT Komplexes zu erweitern. Größere Komplexe (ab 300 kDa) können auch mit elektronenmikroskopischen Methoden visualisiert werden. Letztendlich werden die gewonnenen strukturellen Erkenntnisse direkt in Chlamydomonas reinhartii getestet.