Transkriptionelle Regulierung von L.rubellus Metallothionein

Metallothioneine (MTs) sind multifunktionelle Proteine, die eine entscheidende Rolle in der Entgiftung von Schwermetallen und in der Homöostase von essentiellen Spurenelementen spielen und im gesamten Tierreich vorkommen. Die MT Genexpression wird vom Metal Transcription Factor 1 (MTF-1) gesteuert, der sich an metal responsive elements (MRE) anlagert, die sich auf den jeweiligen Promotorregionen befinden. Studien über transkriptionelle Regulierung von MTs wurden hauptsächlich in Vertebraten durchgeführt. Neben D. melanogaster sind keine Informationen über MT-Regulierung in Invertebraten bekannt. In C. elegans, in L. rubellus und in zwei terrestrischen Schneckenarten konnte bisher auch kein Nachweis für das Vorhandensein von MTF-1 gebracht werden. Im vorliegenden Projektantrag wird der Regenwurm L. rubellus als Modellorganismus herangezogen, um Transkriptionsfaktoren zu finden die sich an die Promotorregion von wMT2 anlagern, einer MT Isoform von der man weiß, dass diese durch Cd2+ induzierbar ist und in der Entgiftung von Cd2+ eine wichtige Rolle spielt. Nukleäre und cytosolische Proteinextrakte aus Kontrollen und Cd2+-belasteten Regenwürmern werden im DNaseI Footprinting Assay verwendet um funktionelle Proteinbindungsstellen in der wMT2 Promotorregion ausfindig zu machen. In EMSA Experimenten wird im Anschluss die jeweilige Promotorsequenz auf die Spezifität der DNA- Protein Bindung untersucht. Beim Screening einer cDNA Expressionslibrary wird der jeweilige Transkriptionsfaktor, der an den Promotor bindet, bestimmt. Das vorliegende Projekt wird Informationen zu funktionellen Protein Bindungsstellen auf der Promotorregion und zu möglichen Unterschieden in Kontrollen und Cd2+-exponierten Proben, aufgrund unterschiedlich gebundener Transkriptionsfaktoren, liefern. Beim Verwenden von nukleären und cytosolischen Proteinextrakten werden darüber hinaus Daten über die mögliche Translokation von Transkriptionsfaktoren vom Cytosol in den Kern zur Verfügung stehen. Diese Experimente werden bei Stephen Stürzenbaum am King`s College in London durchgeführt werden. Während der Rückkehrphase, an der Universität Innsbruck, werden die Ergebnisse von L. rubellus verwendet um durch Screening von Genom-Datenbanken homologe Transkriptionsfaktoren in C. elegans, L. gigantea, und wenn bis dahin vorhanden von B. glabrata, zu finden. Daraus resultierende Sequenzinformationen können verwendet werden um degenerierte Primer herzustellen um in einem experimentellen Ansatz homologe Transkriptionsfaktoren in terrestrischen Schnecken zu finden, da für diese keine genomischen Sequenzen zur Verfügung stehen. Informationen über die MT Induktion in den erwähnten Arten ist außerordentlich wichtig als Basis für zukünftige Projekt der MT Forschung in Invertebraten. Dies wird zusätzlich Biomarker gekoppelte und toxikologische Untersuchungen verbessern und einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis von Entgiftungsmechanismen leisten.