Genomische Analyse der Erkennung von methylierter DNA

DNA-Methylierung spielt eine tragende Rolle in der Genom-Verteidigung und der epigenetischen Transkriptions- Regulierung. Säugetier-spezifische DNA-Methylierung ist dynamisch und wird hauptsächlich and CpG Dinukleotiden vorgefunden. Inkorrekte DNA-Methylierung führt zur unkontrollierter Genaktivität und in vielen Fällen verursacht diese die Entstehung von Krebs. Deshalb ist sowohl eine korrekte DNA-Methylierung als auch deren genaue Interpretation durch Faktoren der Gen-Transkriptions-Maschinerie wesentlich für ein funktionierendes Genom. Letzteres wird teilweise durch eine Gruppe von Proteinen durchgeführt, die mithilfe von "Methyl-CpG-Binding" Domänen (MBD) methylierte DNA spezifisch binden. In vitro Experimente mit MBD Proteinen weisen auf eine mögliche Aktivität als transkriptionelle Inhibitoren, da diese die Fähigkeit besitzen repressive Histon-Methyltransferasen oder Chromatin-Regulatoren in die Nähe von methylierter DNA zu rekrutieren, um dadurch Genaktivität zu reduzieren. Dennoch wurde diese Theorie, die hauptsächlich auf in vitro Experimente beruht, noch nicht in vivo bestätigt und darüber hinaus durch jüngere Berichte angefochten. Mit diesem Projekt möchte ich eine ausführliche und funktionelle in vivo Analyse von MBD Protein-Interaktionen und deren regulative Funktion durchführen. Zu diesem Zweck werde ich - durch Einbeziehung von kontrollierter und gezielter Gen-Rekombination und effizienter Biotin-Markierung - die genomische Lokalisation von wild-typ und mutierten MBD Proteinen kartieren. Dieser Ansatz erlaubt Affinitäts-Probleme, die durch gewöhnliche, auf Antikörper basierende Methoden entstehen, und daher "high-throughput" Analysen unmöglich machen, zu umgehen. Weiters erlaubt die hier verwendete Methodologie eine effiziente Analyse von mehreren Protein- Isoformen und -Mutationen um funktionelle Domänen in vivo zu charakterisieren. Zusätzlich werde ich im Laufe des Projekts eine Genom-weite, quantitative Bindungsanalyse von MBD Proteinen an methylierter DNA durchführen. Die genomische und methyl-CpG spezifische MBD-Kartierung wird anschließend mit dynamischen Veränderungen der DNA-Methilierungs- und Chromatin-Modifikations-Muster während neuronaler Stammzelldifferenzierung korreliert.