Transkutane Immunisierung mit HPV Pseudoviren

Auf humanen Papillomviren (HPV)-basierende Pseudovirionen (PsV) wurden erstmalig im Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute, National Institutes of Health entwickelt. PsV bestehen aus dem viralen Kapsid (Virushülle), enthalten jedoch statt der viralen DNA ein Reporterplasmid, welches für unterschiedliche Antigene kodieren kann. Die Anwendung von PsV als Gentransfervektoren bei Vakzinierungen wird derzeit evaluiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch intranasale oder intravaginale Immunisierungen mit HPV PsV, welche ein Modellantigen exprimieren, systemische und mukosale antigen-spezifische zelluläre und humorale Immunantworten in einem etablierten Mausmodell induziert werden. Eine Infektion muriner Haut mit HPV PsV hingegen erscheint bis dato jedoch wenig effizient. Die transkutane Immunisierung (TCI) stellt eine neue und vielversprechende Strategie für die Induktion systemischer und mukosaler B Zell- und T Zell-Immunantworten auf topisch applizierte Antigene dar. Durch eine transkutane genetische Immunisierung mit einem Gentransfervektor wie PsV epitheliotroper HPV Typen könnte eine potente und effiziente zelluläre Immunantwort gegen von PsV exprimierte Antigene erreicht werden. Zunächst wird eine effiziente TCI Strategie mit PsV kutaner und genitaler/mukosaler HPV Typen in einem Mausmodell etabliert. Mit Hilfe von HPV PsV, welche ein Modellantigen exprimieren, wird dann untersucht, ob eine potente antigen-spezifische Immunantwort in den vakzinierten Mäusen induziert werden kann. Antigen- spezifische Antikörper werden in Blut und Schleimhautsekreten gemessen. Lokale und systemische CD4+ und CD8+ T Zellen werden in Blut und unterschiedlichen Geweben (Haut, Lymphknoten, Lunge, Milz, Gastrointestinal- und Genitaltrakt) bestimmt. Die induzierten T Zellen werden weiters in Hinblick auf ihren Phänotyp, ihre bevorzugte Migration in verschiedene Gewebekompartimente und ihre Lokalisation innerhalb der Gewebe charakterisiert. Als nächstes werden verschiedene prime-boost Vakzinierungsprotokolle (transkutan versus Schleimhaut) auf ihre Effizienz beurteilt. Es wird u.a. bestimmt, ob TCI mit HPV PsV in der Lage ist als Boost für intravaginale oder intranasale Vakzinierungen zu dienen und vice versa. Die effizienteste TCI Strategie für die Induktion einer zellulären antigen-spezifischen Immunantwort wird schließlich in einem etablierten transgenen (tg) Mausmodell für HPV-assoziierte Tumoren, in dem das Onkoprotein E7 des Hoch-Risiko HPV Typs 16 als Transgen unter dem Basalzell-spezifischen Promoter Keratin 14 (K14) exprimiert wird, evaluiert. Diese tg K14E7 Mäuse entwickeln Hautkarzinome. Hauttransplantate dieser K14E7 Mäuse in syngene, nicht-tg, E7 nave Mäuse stellen ein Modell für HPV-assozierte anogenitale Dysplasien und Karzinome dar, in denen die Expression des HPV Onkoproteins E7 in Epithelzellen aufrechterhalten wird. Mit Hilfe von neu generierten HPV PsV, welche ein modifiziertes Onkoprotein E7 des HPV Typs 16 ohne transformierende (onkogene) Eigenschaft enthalten, wird der Effekt einer HPV PsV TCI auf eine Abstoßung des tg Hauttransplantats in dem tg K14E7 Mausmodell untersucht und die Induktion einer zellulären E7-spezifischen Immunantwort sowie eine mögliche Abstoßung des Transplantats bestimmt.

Infektionen mit (PV) Papillomviren können bei Menschen und Tieren an Haut und Schleimhäuten benigne Warzen (Papillome) sowie epitheliale Neoplasien, insbesondere anogenitale und oropharyngeale Karzinome und in genetisch prädisponierten Individuen kutane Plattenepithelkarzinome, verursachen. Das zelluläre Immunsystem wurde bislang für die effiziente Kontrolle und die Clearance der viralen Infektion sowie der Entstehung der Läsionen verantwortlich gemacht. Experimentellee Beweise hierfür sind allerdings noch ausständig. Die kürzliche Identifizierung des ersten murinen PV (MusPV1, auch als MmuPV1 bezeichnet), das domestizierte Mäuse infiziert, repräsentiert nun eine exzellente Gelegenheit die natürliche Infektion eines kutanen PV in der natürlichen Wirtsspezies zu untersuchen. Zunächst etablierten wir mit Hilfe von PV Pseudovirionen (PsV) eine verbesserte Methode für die Infektion muriner Haut. PsV bestehen aus dem viralen Kapsid, welches anstelle des viralen Genoms plasmid-kodierte Antigen umfasst, und werden derzeit als Vehikel für Gentransfer untersucht. Die neue Infektionsmethode ermöglichte uns zu zeigen, dass synthetische DNA des MusPV1 nach experimenteller Transmission die Entstehung von Papillomen an der Haut immundefizienter Mäusen induziert, aus denen native, infektiöse Virionen extrahiert werden konnte. Dies erlaubt zukünftig Studien in vitro und in vivo unabhängig von einer natürlich vorkommenden viralen Quelle. MusPV1 Infektionen konnten in vivo seriell passagiert werden, ohne Verlust einer Transmissionseffizienz oder viraler Infektiosität. Durch passiven Transfer von Antikörpern gegen das Hauptkapsidprotein L1 von MusPV1 konnte eine Transmission vollständig verhindert werden, was beweist, dass die Infektion Virus-abhängig ist. Wir konnten auch überraschende Region-spezifische Unterschiede in der Empfänglichkeit für MusPV1 Infektionen aufdecken und zeigen, dass diese Spezifität auf intrazelluläre Faktoren zurückzuführen ist. Als nächstes untersuchten wir immunkompetente Mäuse auf MusPV1 Infektion und die Entstehung von Papillomen. Wir konnten zeigen, dass in Immunkompetenten Mäusen MusPV1 normalerweise eine asymptomatische Hautinfektion verursacht. Sichtbare Läsionen wurden nur in einem besonders empfänglichen immunkompetenten Mausstamm nach Verwendung extrem hoher Mengen an MusPV1 Viren für die Infektion beobachtet. Nach systemischer Immunsuppression wurde die Entstehung von Papillomen in manchen, aber nicht in allen untersuchten Mausstämmen gezeigt. Nach selektiver Entfernung definierter zellulärer Immunozyten und unter Verwendung genetisch modifizierter Mäuse konnten wir zeigen, dass T-Zellen obligat waren für die Kontrolle einer PV Infektion und assoziierter Erkrankungen, und dass erstaunliche Unterschiede in der zellulären Immunität zwischen unterschiedlichen Mausstämmen bestanden, was auf unvorhergesehene Effektormechanismen hinweist, die für die Kontrolle einer viralen PV Infektion zuständig sind. Unsere Resultate könnten hilfreich sein, die Vielfalt der Pathologien nach Infektion mit einem bestimmten humanen PV Typ in immunkompetenten Patienten zu erklären. MusPV1 stellt ein wertvolles Tiermodell für die Untersuchung von kutanen PV in immundefizienten sowie immunkompetenten Individuen dar.