Centromer Struktur, Aufbau und Funktion

Das Centromere und das Kinetochore welches daran gebildet wird sind entscheidend für die richtige Aufteilung der Chromosomen während der Mitose oder der Meiose. Die Mikrotubulie der mitotischen Spindel binden am Kinetochore und ermöglichen den Transport der Schwester Chromosomen zu den Spindel Polen. Defekte in dieser Chromosomen Aufteilung führen zu extra oder fehlenden Chromosomen in den Tochterzellen (aneuploidy), was Geburtsdefekte auslöst und im Zusammenhang mit Krebs steht. Der Ursprung dieser Aufteilungsdefekte wird in der Struktur des Centromere-Kinetochore Komplexes gesehen. Um die Struktur und den Aufbau dieses Komplexes zu verstehen werden wir die Spaltungshefe Schizosaccharomyces pombe als Modellsystem verwenden. Deren Centromere haben viele Eigenschaften mit denen von Metazoen gemein, da sie sehr groß (40-120kb) sind, aus sich wiederholenden Elementen (SWE) aufgebaut sind und die äußeren SWE (otr) sind in Heterochromatin verpackt. Diese heterochromatischen Regionen flankieren die Zentrale Kern Domäne (cc/cnt und inneren SWE; imr), wo das Histone H3 durch seine Variante CENP-ACnp1 ersetzt ist, was epigenetisch reguliert wird. Unsere Hypothese besagt, dass die 3 dimensionale Struktur und der Chromatin Aufbau entscheidend sind für die korrekte Aufteilung der Chromosomen. Eine Möglichkeit ist, dass die symmetrischen äußeren und inneren SWE eine Interaktion zwischen den rechten und linken Seiten der Centromere bewirken. Tatsächlich wird diese Hypothese von vorläufigen 3C Ergebnissen gestützt. Unsere spezifischen Zielvorgaben sind: 1. Messung der Distanz und der Interaktion zwischen den äußeren SWE der Centromere und der Feststellung von welchen Proteinen diese Interaktionen abhängen. 2. Festzustellen ob diese Interaktionen mit unterschiedlichen Zellzyclus-stadien zusammenhängen. 3. Analyse der Verteilung der Histonevariante CENP-A Cnp1 innerhalb der Centromere in nucleosomaler Auflösung. Diese Ziele werden mithilfe der folgenden molekularbiologischen Technologien erfüllt: 1. 3C (Chromosome Konformation Erfassung) 2. ChIP (Chromatin immuno Fällung) 3. Hochdurchsatz Sequenzierung mithilfe der SOLEXA oder 454 Systeme 4. Mikroskopie (fluorescent- und confocal fluorescent- Mikroskopie) Diese Technologien werden einzeln oder in Kombinationen angewendet. Das Hauptziel dieses Projekts ist es herauszufinden welche Faktoren die Architektur der S. pombe Centromere beeinflussen und wie diese zu Kinetochore Aufbau und Funktion beiträgt.