Entwicklung neuer Techniken für allelische Charakterisierung

Erwin-Schrödinger-Stipendium J 1922Entwicklung neuer Techniken für allelische CharakterisierungAndreas PREMSTALLER08.05.2000 Die Entdeckung und Identifikation von Variationen der DNA Sequenz stellt ein wichtiges Werkzeug zur Analyse des Genoms dar. Speziell Punktmutationen spielen bei der Diagnose von Krankheiten eine wichtige Rolle und ihre Erkennung und Genotypisierung ist für die genetische Analyse von vererbbaren Krankheiten, v.a. wenn sie sich aus komplexen Mustern von Mutationen ergeben, von fundamentaler Bedeutung. Mit zunehmender Kenntnis der Sequenz des menschlichen Erbguts steigt der Bedarf nach empfindlichen und automatisierbaren Methoden mit hohem Probendurchsatz. Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC) kann einzelne Fehler in der Basenpaarung in amplifizierten PCR-Produkten mit einer Länge im Bereich von 80 bis 2000 Basenpaaren nachweisen. Hocheffizienten Trennsysteme können dabei partiell denaturierte DNA-Fragmente durch sorgfältige Wahl der Temperatur in Homo- und Heteroduplices auflösen. Mit Ausnahme sehr AT- oder GC-reichen Sequenze ermöglicht dabei ein einzelner Satz von Analysenbedingungen die Entdeckung aller Punktmutationen, sowie von Deletionen und Insertionen. Der Anwendungsbereich der DHPLC für die allelische Charakterisierung wird durch massenspektrometrische Detektion wesentlich erweitert werden. Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung neuer Techniken zur allelischen Charakterisierung durch Anwendung von flüssigchromatographischen Techniken mit massenspektrometrischer Detektion. Die Verwendung von Massenspektrometrie mit Elektrospray-lonisation als Detektionsmethode für Ionenpaar-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie unter vollständig denaturierenden Bedingungen ermöglicht die genaue und schnelle Detektion und Genotypisierung von Mutationen. Darüber hinaus ermöglichen die massenspektrometrischen Informationen über die Fragmente eine Genotypisierung von Mutationen, die der Analyse mittels DHPLC und optischer Detektoren nicht zugänglich sind. Der niedrige Probendurchsatz von chromatographischen Analysensystemen wird durch die parallele Analyse einer Vielzahl von Proben wesentlich verbessert werden, indem mittels abspaltbarer massenspektrometrischer Marker zwischen Proben verschiedener Individuen bzw. verschiedener genetischer Loci unterschieden wird. Geplant ist dazu die Konstruktion eines speziellen Analysensystems, das die gleichzeitige chromatographische Trennung einer Vielzahl von PCR-Produkten, gefolgt von einer On-line-Abspaltung der massenspektrometrischen Marker und der Massenbestimmung durch eine massenspektrometrische Messung mit chemischer Ionisation bei Atmospharendruck ermöglicht. Dadurch wird eine drastische Steigerung des Probendurchsatzes für das routinemäßige Screening nach Mutationen erzielt werden. Die neu entwickelten Techniken werden zu einem besseren Verständnis von menschlichen Krankheiten und der Evolution beitragen und in der klinischen Diagnostik Anwendung finden, besonders beim Abschätzen des Risikos von Brustkrebs durch Nachweis von Brustkrebsgenen.