Biokatalytische Redox Kaskaden mittels Baeyer-Villiger Monooxygenasen

Dieses kooperative Forschungsvorhaben zielt auf die Entwicklung künstlicher Stoffwechselpfade ab. Dazu sollen zunächst anhand einfacher Modellsysteme die prinzipiellen Eigenschaften von Enzym-Kaskaden bestimmt werden, welche sich nicht in einem evolutionären Kontext entwickeln konnten, sondern vielmehr de novo geschaffen wurden. Um möglichst viele Einflußparameter bereits in den Modellsystemen erfassen zu können, wurden explizit Redox-Biotransformationen gewählt, welche Cofaktor-abhängig und somit in den Primärmetabolismus des Wirtsorganismus (E. coli) eingebunden sind. In einem ersten Drei-Enzym-Modell (Reduktase, Oxygenase, Cofaktorrecyclierung) soll somit die grundlegende Wechselwirkung zwischen Biokatalysatoren ohne natürliche gegenseitige Regelmechanismen im Wechselspiel mit dem Energiehaushalt des Wirtes untersucht werden. Basierend auf den erhaltenen Daten und durchgeführten Optimierungen des Systems soll anschließend die Komplexität der Redox-Reaktionskaskade zunehmend erhöht werden, um die Tragfähigkeit dieses Forschungsansatzes hinsichtlich der Produktion von chemischen Zielverbindungen abschätzen zu können.

Der Zellmetabolismus besteht aus einem effektiven System an Enzymkaskaden, um das Leben zu ermöglichen. Hier werden Stoffe ohne Aufarbeitung über verschiedene Intermediate selektiv zum Produkt umgesetzt. Die Ersparnis an Zeit, Kosten und Abfall durch den Wegfall von Reinigungen der Zwischenprodukte und der direkte Umsatz von toxischen oder instabilen Intermediaten zum Produkt machen Kaskadenreaktionen zu einem aktuellen und interessanten Anwendungsbereich der Biotechnologie. Im Rahmen dieses Kooperationsprojektes zwischen der Universität Greifswald und der TU Wien konnte erstmalig eine in vivo Enzymkaskade bestehend aus drei Oxidoreduktasen zur Darstellung optisch aktiver Lactone via Desymmetrisierung bzw. enantiokonvergenter Reaktionen für die organische Synthese erfolgreich etabliert werden. Für diese in vivo Enzymkaskade bestehend aus Reduktasen und Oxygenasen konnte eine ganze Reihe geeigneter Enzyme identifiziert und funktionell in E. coli hergestellt werden. Mit zwei komplementär selektiven Dehydrogenasen konnte eine Oxidation von chiralen Cyclohexenol-Derivaten und Carveolen zu den entsprechenden prochiralen Ketonen erfolgen. Drei neue Enoatreduktasen, die sowohl aliphatische als auch cyclische Ketone und Aldehyde akzeptieren und exzellente Stereoselektivitäten zeigten, konnten ebenfalls identifiziert und umfassend biochemisch charakterisiert werden. Nach umfangreichen molekularbiologischen Arbeiten gelang es, alle Enzymkombinationen für die Kaskade löslich und aktiv in einem E. coli-Stamm zu exprimieren. Mit der Kombination verschiedener nicht-natürlich verbundener Biokatalysatoren konnten in vivo Cyclohexenol und einfach Methyl-substituierte Cyclohexenol-Derivate selektiv zu chiralen Lactonen umgesetzt werden. Durch den modularen Aufbau kann die Kaskade flexibel an verschiedene Substrate und Stereopräferenzen angepasst werden. Die Umsatzgeschwindigkeit konnte mit Hilfe von Fusionsproteinen nochmals gesteigert werden. Durch die Anwendung einer Mischkultur aus R. equi und E. coli mit der synthetischen Enzymkaskade war die Umsetzung von Limonen zu den gewünschten Dihydrocarvonlactonen möglich. Schließlich wurden auch noch erfolgreich Studien durchgeführt zur Kopplung eines in-situ Extraktionsprozesses von Limonen aus Orangenschalen mittels Ionischer Flüssigkeiten mit dem Mischkultursystem zur direkten Herstellung der Zielproduktlactone; dies stellt eine erstmalige Kombination einer artifiziellen Enzymkaskade zur nachhaltigen Nutzung biogener Rohstoffe bei der Herstellung zukünftiger Plattformchemikalien dar.Folglich konnten alle Ziele des Vorhabens erreicht und die Etablierung einer modularen in vivo Enzymkaskade für die Herstellung chiraler Lactone gezeigt werden.