Oxystress und humanpathogene Pilze: Klinisch angewandte Aspekte

Dieses Teilprojekt wird sich auf angewandte Aspekte von Oxystress und Pilzpathogenen konzentrieren; wir erforschen, ob Hypoxie oder ROS (Reactive oxygen species) die Wechselwirkung von Antimykotika (Polyene, Candine und Azole) und Pilzen, die Produktion von pilzlichen Metaboliten und/oder Biomarkern und Zellen der angeborenen Immunität im Kampf gegen Pilze beeinflussen. Jeglicher Einfluss auf die Pilz/Antimykotika- Interaktion hat therapeutische Implikationen und die Abgabe von Biomarkern ist die Basis für eine frühe und spezifische Diagnose invasiver lebensbedrohlicher Pilzinfektionen; so ist die Ausschüttung von Zytokinen und die Interaktion von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten ein wesentlicher Bestandteil um die Germination und Aushyphung von Pilzsporen zu verhindern. Diese Abläufe müssen in Bezug auf die Sauerstoff-Verfügbarkeit (Normoxie/Hypoxie) untersucht werden, um eine klinisch-therapeutische Implikation ableiten zu können. Mehrere experimentelle Modelle werden in diesem Arbeitspaket verwendet: 1. Untersuchung zur antifungalen Aktivität unter Hypoxie und ROS. Wir werden die in vitro Aktivität der klinisch wichtigsten Antimykotika gegen Candida albicans, Aspergillus fumigatus und Zygomyzeten (Rizhopus oryzae, Mucor spezies) unter Normoxie und Hypoxie untersuchen. Eine antifungale Resistenz wird gewöhnlich über die minimale Hemmkonzentration (MHK) definiert; die Bewertung der in vitro Aktivität von Echinocandinen gegenüber Schimmelpilzen wird durch die Tatsache verkompliziert, als dass die MHKs unter Normoxie sicher erreichbare Plasmakonzentrationen überschreiten und das Phänomen vom "Trailing" aufzeigen. Erste eigene Daten zeigten, dass MHK-Endpunkte für Anidulafungin, Caspofungin und Micafungin unter Hypoxie Bedingungen (1-%- Sauerstoff) optimal abzulesen sind. Die zugrunde liegenden Faktoren sind nicht bekannt, sollten aber innerhalb dieses Projektes geklärt werden. Weiters werden wir Isolate auf das Vorhandensein von Kreuzresistenzen unter Hypoxie und ROS untersuchen und die MHKs molekularbiologisch definierter resistenter Pilze unter Oxystress bewerten. An Oxystress- angepasste Pilzmutanten werden mittels MHK analysiert. 2. Biomarker Abgabe. Pilze sondern eine groöße Vielzahl an Molekülen wie Enzyme und Kohlenhydrate ab; dies erfolgt auch im infizierten Organ. Die Detektion von Pilzantigenen im Serum für Aspergillus Galactomannan (GM) oder ß-D-Glucan stellt mittlerweile eine akzeptierte diagnostische Strategie dar. Jedoch schwanken die Sensitivität und Spezifität stark und die Gründe dafür sind nur teilweise klar; deshalb werden wirüberprüfen, ob Normoxie und Hypoxie die Kinetik der GM und ß-D- Glucan-Abgabe beeinflussen. 3. Oxystress und neue antifungale Substanzen (Kollaboration mit PFIZER). Es werden neue Antimykotika gebraucht, da die Zahl von Patienten, welche mit Antimykotika-resistenten Pilzen infiziert sind, rasant steigt. Die vorhandenen Medikamente sind nur begrenzt gegen die Vielzahl der pilzlichen Erreger wirksam. Ziel ist die Identifizierung/Entwicklung von Substanzen, die neue antifungale Targets (zB Moleküle bei Adaptation unter Oxystress/Hypoxie) angreifen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Ergebnisse der AG 1-3 neue antifungale Targets detektieren, welche dann über ein "Antifungal Screening" in Kollaboration mit PFIZER bewertet werden. Auößerdem soll die Kombination diverser Antimykotika (Synergismus/Antagonismus) unter Hypoxie, CO2 und/oder ROS untersucht werden. 4. Virulenz im Mausmodell. Etablierte Tierinfektionsmodelle werden helfen, die Virulenz von C. albicans- Mutanten (zB Fehlen von Oxystress-Regulatoren) bewerten zu können. In Analogie wird für Aspergillus fumigatus ein inhalatives Mausmodell verwendet um die Virulenz diverser Mutanten untersuchen zu können. Auößerdem wird das Wachstum der Mutanten innerhalb des Lungengewebes histopathologisch untersucht. 5. In vitro Immun-Antwort. Um die Effektivität der Phagozyten zu evaluieren, werden in Kombination mit anderen Untersuchungen/Methoden der "conidiocidal assay", der "germination inhibition assay" und der "phagocytosis assay" unter Oxystress durchgeführt.

In den letzten Jahrzehnten konnte ein kontinuierlicher Anstieg an invasiven Pilzinfektionen beobachtet werden. In Risikogruppen, das sind PatientInnen, deren Immunsystem stark beeinträchtigt ist, wie etwa nach Knochenmarkstransplantationen oder unter Chemotherapie, stellen invasive Verlaufsformen eine schwerwiegende und oftmals lebensbedrohliche Komplikation dar. Candida und Aspergillus-Spezies sind die häufigsten Erreger solcher Infektionen, jedoch treten kürzlich atypischen Pilzpathogenen wie die Mucorales vermehrt auf. Angesichts der Komplexität an Patienten-Risikofaktoren plus der zunehmenden Vielfalt an unterschiedlichen Pathogenen, bleibt die Diagnose sowie die Therapie eine große Herausforderung für den Kliniker und es gilt, beides zu verbessern, um solche Infektionen erfolgreich behandeln zu können. Dazu ist ein detailliertes Verständnis der Infektionsentstehung und der Abwehrmechanismen im Körper notwendig. Im Rahmen dieses Projektes untersuchten wir inwiefern die extrem niedrigen Sauerstoffkonzentrationen, die am Ort der Infektion, meist ist dies die Lunge, herrschen, Einfluss auf das Auskeimen und Wachstum von Pilzpathogenen, die Abgabe von Biomarkern in die Umgebung, sowie die Empfindlichkeit gegenüber Antimykotika haben können.Als Biomarker werden Enzyme oder Kohlehydrate bezeichnet, die der Pilz an seine Umgebung abgibt und die bei einer Infektion im Serum nachgewiesen werden können. Für zwei dieser Marker, Galactomannan und beta-D-Glucan, stehen bereits kommerziell erhältliche Detektionskits zu Verfügung. Die Sensitivität und Spezifität unterliegt jedoch starken Schwankungen und Gründe dafür sind noch nicht eindeutig geklärt. Unsere Untersuchungen zeigten, dass hypoxische Bedingungen die Abgabe von Galaktomannan und ?-(1,3)-Glukan nur marginal beeinflusst, da eine erhöhte Abgabe nur in frühen Zeitpunkten festgestellt wurde. Eine Verbesserung von in vitro Empfindlichkeitstestungen trägt maßgeblich zu einer optimierten Therapie bei. Standard Methoden zur Empfindlichkeitstestung werden unter atmosphärischen Sauerstoffbedingungen durchgeführt und die antifungale Wirkung wird auf Konidien getestet. In vivo Bedingungen, wie Hypoxie, fließen somit nicht in die Testung ein. Die antifungale Wirkung auf Hyphen kann zudem enorm von jener getestet auf Konidien abweichen. Wir konnten zeigen, dass Unterschiede in der minimalen Hemmkonzentration (MHK) aufgrund hypoxischer Wachstumsbedingungen von der Testmethode (Etest oder EUCAST), der Pilzspezies und deren Fähigkeit in Hypoxie zu wachsen, abhängig sind. Ein vereinfachtes visuelles Ablesen der MHK ist unter Hypoxie jedoch erkennbar. Für alle getesteten Pilzspezies war keine Veränderung in der antifungalen Aktivität sichtbar, mit Ausnahme von A. terreus Stämmen, wo eine Veränderung von fungizider zu fungistatischer Wirkung sichtbar war.Weiters wurde eine verringerte Schädigung durch Azole auf Aspergillus-Hyphen unter hypoxischen Wachstumsbedingungen detektiert, was mit einer Veränderung in der Sterol-Biosynthese, dem Ziel der Azole, von A. fumigatus einherging. Zusammenfassend weist das auf eine verminderte Wirksamkeit von Azolen unter niedrigen Sauerstoffkonzentrationen hin.