Regulationsmechanismen von KLK-Proteasen aus Prostata

Die humanen Gewebskallikreine (kallikrein-related peptidases, KLKs) bilden eine Familie (chymo)trypsin-artiger Serinproteasen, die als enzymatisch inaktive Zymogene synthetisiert werden. Vier dieser KLKs (KLK2, 3, 4 & 11) werden vorwiegend in der Prostata exprimiert, wobei sie in die Prostataflüssigkeit sezerniert werden und durch Aktivierungskaskaden aus der Zymogen-Form in proteolytisch aktivierte KLKs umgewandelt werden. KLK3 spielt eine wichtige physiologische Rolle bei der Spaltung gelbildender Proteine in der Samenflüssigkeit. Darüberhinaus wird KLK3 (alias PSA) als klinischer Marker für die Diagnose von Prostatakrebs verwendet. Zudem werden KLK2 und KLK4 als vielversprechende prognostische Marker von Prostatakrebs angesehen. Sowohl die Aktivierung als auch die Regulation der proteolytischen Aktivität der vier KLKs aus Prostata stehen im Zentrum unseres Projekts. Zu diesem Zweck werden wir enzymkinetische Parameter in Abhängigkeit von physiologischen Regulatoren wie Zn2+ oder Ca2+-Ionen, der Glykosylierung, sowie von synthetischen und natürlichen Inhibitoren messen. Diese Ergebnisse werden wir durch röntgenkristallographische Strukturbestimmungen untermauern und interpretieren. Mechanistische Details der Zymogenaktivierung, der Enzymaktivität und deren jeweiliger Regulation werden mittels Mutationsanalyse validiert, die von biophysikalischen Studien begleitet wird. Wir konnten in vorausgehenden Arbeiten die Tetramer- und Oktamerbildung von KLK3 und 4 beobachten, welche deren Proteaseaktivität drastisch verringert und deshalb ein wesentliches regulatorisches Prinzip der KLKs aus Prostata darstellen könnte. Folglich schlagen wir vor, die strukturelle und mechanistische Grundlage dieses Oligomerisierungsprozesses aufzuklären. Außerdem sollten die verfügbaren KLK-Varianten und -Komplexe zur Entwicklung neuer Antikörpertests beitragen, mit denen bei Prostatakrebs verschobene KLK-Konzentrationen festgestellt werden können, und eventuell eine verbesserte Prognose des Krankheitsverlaufs erzielt werden kann. Parallel dazu werden wir die Regulation der KLK-Aktivität durch Funktionsstudien in humanen Prostatakarzinomzellen wie DU-145 erforschen. Diese Zellen werden mit Wildtyp- oder mutierten KLK- Expressionsplasmiden transfiziert. Damit kann der Effekt der Proteaseaktivität einzelner oder kombinierter KLKs auf die Proliferation, Adhäsion, Migration und Invasion von Prostata-karzinomzellen aufgeklärt werden. Schließlich erwarten wir, durch Überexpression und/oder Modulation der KLK-Aktivität in Tiermodellen das "Prostatakrebs- Aktivom" zu skizzieren. Solchermaßen identifizierte Targets dienen u. a. der Entwicklung neuer Therapiekonzepte zur Behandlung von Prostatakrebs. Die Analyse von Kristallstrukturen ist eine Voraussetzung für das rationale Design von Inhibitorverbindungen als zukünftige Pharmazeutika. Unser Projekt nutzt wirkungsvoll Synergismen interdisziplinärer Forschung, die von der KLK-Aktivitätsregulation in Organismen bis zur atomaren Auflösung der untersuchten Proteasen aus Prostata reicht.

Humane Gewebskallikreine (KLKs) sind eine Familie von Serinproteasen, die außerhalb von Zellen aktiv sind. Vier Vertreter, KLK2, 3, 4 & 11 werden hauptsächlich von der Prostata produziert und sorgen für die Beweglichkeit der Spermien durch Abbau gelbildendender Proteine. Am bekanntesten ist KLK3 (PSA), das als klinischer Marker für Prostatakrebs verwendet wird. Mittels Röntgenkristallographie konnte die Struktur des KLK2 aufgeklärt werden und seine Funktionsweise bei der Aktivierung, der spezifischen Substratbindung und der enzymatischen Aktivität erhellt werden. Insbesondere der sogenannte 99-loop, ein flexibler Abschnitt am aktiven Zentrum erwies sich als wichtiges regulatorisches Element, das beispielsweise aktivitätshemmende, physiologisch wichtige Zn2+ - Ionen bindet. Aus eukaryotischen Leishmania-Zellkulturen wurde eine KLK2-Variante erhalten, bei der am 99- loop Zuckermoleküle angeheftet waren. Derartige Modifikationen (Glykosylierung) kommen natürlicherweise vor, können aber nicht in E. coli-Bakterienkulturen erzeugt werden. Durch Vergleich des glykosylierten mit dem zuckerfreien KLK2 konnte eine regulatorische Funktion des Zuckers für die Proteaseaktivität und seine Schutzfunktion gegen den Selbstabbau der Protease erklärt werden. Alle vier KLKs wurden als inaktive Proformen hergestellt, wobei die aus Bakterienkulturen Gereinigten zunächst rückgefaltet wurden, bevor sie durch das Enzym Enterokinase mittels Abspaltung eines Propeptids vom N-terminus aktiviert wurden. Zudem wurde ein einfaches und effizientes Verfahren zur Reinigung rekombinanter Enterokinase etabliert. Dadurch ließen sich die KLKs 3, 4 und 11 aktivieren, während eine KLK2-Variante auch zur Selbstaktivierung fähig war. Zwar gelang es in ähnlicher Weise Proformen der vier KLKs zu reinigen, doch erwies sich das Zuschneiden auf die korrekten N-terminalen Aminosäurereste mit verschiedenen aktivierenden Proteasen als schwierig. Ebenso wie bei KLK2 gelang es glykosylierte Varianten von KLK3, 4 und 11 herzustellen und die spezifischen Glykosylierungsstellen mittels Massenspektrometrie zu charakterisieren, was wichtig für weitere biochemische Analysen ist. In Kooperation mit der klinischen Forscher- gruppe der TU München (V. Magdolen) konnte die Regulation der KLK-Aktivität in humanen Prostatakrebszellen wie PC-3 erforscht werden. Die stabile Transfektion mit Expressions- plasmiden von KLKs hatte deutliche Auswirkungen auf Proliferation, Adhäsion, Migration und Invasion von Prostatakrebszellen. Zudem konnten in Zusammenarbeit mit der Universität Antwerpen (K. Augustyns, J. Joossens) sehr spezifische synthetische KLK4-Inhibitoren gefunden werden, die Metastasierung bei Prostatakrebs verhindern könnten. Auch die Rolle der Zuckermoleküle der KLKs aus Prostata wird nun besser verständlich und bedeutsamer, zumal diese bei Krebserkrankungen verändert sind, und wie KLK-Inhibitoren in der Medizin bei der Diagnose oder Therapie von Prostatakrebs verwendet werden können.