Tumor-targeting von therapeutischen Oligonukleotiden

Die Modulierung der Funktion einzelner Gene durch RNA Interferenz, vor allem mit kurzen RNA Sequenzen (siRNAs), hat während der letzten 10 Jahre eine immense Bedeutung in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung erlangt. Der Einsatz dieses Prinzips zur gezielten Hemmung einzelner Gene verspricht auch in der medizinischen Anwendung enorme Fortschritte vor allem in der Krebstherapie. Allerdings zeigten bisherige Bemühungen sowie Erfahrungen mit einer nahe verwandten Wirkstoffklasse, der Antisense Oligonukleotide, die Schwierigkeiten einer therapeutischen Anwendung. Insbesondere das Problem, die Wirkstoffe an ihren intrazellulären Wirkort zu bringen, konnte noch nicht zufriedenstellend gelöst werden, weil die inhärenten molekularen Eigenschaften von Nukleinsäurederivaten die Bioverfügbarkeit und Zellaufnahme negativ beeinflussen. Zusätzlich müssen auch Probleme der Spezifität, der unerwünschten Immunaktivierung sowie unzureichender Plasmastabilität gelöst werden, um schließlich im Sinne der personalisierten Medizin hochaktive, auf molekularer Ebene spezifisch angreifende Wirkstoffe zu entwickeln. In diesem grenzüberschreitenden Projekt soll ein neuentwickeltes Nanosystem zum zielgerichteten Transport von chemisch veränderten Antisense und siRNA Molekülen in Tumorzellen optimiert und getestet werden. Das Transportsystem macht sich die überlegenen Eigenschaften von DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins) zunutze, die hochaffin das tumorspezifische Antigen EpCAM erkennen können. Diese Proteine können als Trägerstoffe für Antisense und siRNA Wirkstoffe zum gezielten Transport in Krebszellen eingesetzt werden. Nachdem in unseren Vorarbeiten die Eignung eines solchen Transportsystems zur Tumorerkennung gezeigt wurde, soll es nun in Hinblick auf Affinität, Beladungskapazität und Wirkstofffreisetzung optimiert werden. Der bindende DARPin-Teil wird durch Selektion von Proteinen mit erhöhter Affinität sowie durch eine Multimerisierungsstrategie verbessert, und die Verknüpfung mit Antisense und siRNA Oligonukleotiden soll durch Evaluierung verschiedener Bindungs- und Komplexierungsmethoden perfektioniert werden. Schließlich werden neue chemische Modifikationen von siRNAs, die in Hinblick auf Stabilität, Zellmembranpermeation und Minimierung von Nebenwirkungen entwickelt wurden, eingesetzt. Die generierten Nanosysteme werden in Tumormodellen zunächst in vitro und später in vivo getestet, um Informationen über die Bedeutung der einzelnen Komponenten zu erhalten und die bestmöglichen Kandidaten für weitere Entwicklungsarbeiten zu identifizieren. Zusätzlich zu den etablierten Testmethoden sollen mit modernen systembiologischen Analysenverfahren umfangreiche Daten bezüglich molekularer Spezifität und Details über den Wirkungsmechanismus gesammelt werden. Dieses Projekt wird durch die enge Kooperation einer schweizerischen Arbeitsgruppe in Bern bzw. Zürich, die führend in der Entwicklung tumorgerichteter Proteinliganden wie DARPins ist, und einer Gruppe aus Wien, die auf die Optimierung und Testung von therapeutischen Nukleinsäurestrukturen spezialisiert ist, ermöglicht.

Das Projekt befasste sich mit der Entwicklung von DARPin-basierten Trägersystemen zur Anwendung von therapeutischen Oligonukleotiden. Die Antisense- und siRNA-Technologie verspricht große Fortschritte in der Behandlung verschiedener Erkrankungen, darunter Krebs, Virusinfektionen und Autoimmunerkrankungen. Aufgrund der Sequenzspezifität der Nukleinsäureerkennung kann praktisch jede beliebige Genfunktion gehemmt werden und durch wirksame Oligonukleotide können somit bisher nicht verfügbare therapeutische Zielmoleküle angegriffen werden. Allerdings müssen für einen breiten pharmazeutischen Einsatz zunächst die Probleme betreffend Bioverfügbarkeit (Transport der Wirkstoffe an den Wirkort in einzelnen Zellen), Stabilität und Zellspezifität gelöst werden. Designed Ankyrin Repeat Proteine sind artifizielle Bindungsproteine, die ähnliche Affinitäten wie Antikörper aufweisen, aber aufgrund ihrer einfacheren Struktur, kleineren Molekülgröße, hohen Stabilität und dem Fehlen von posttranslationalen Modifikationen auf einfachere Weise produziert und für die Komplexierung bzw. Kopplung an Effektormolekülen verändert werden können. Dadurch sind sie hervorragend als Trägermoleküle für spezifischen Transport an Tumorzellen geeignet. In diesem Projekt wurde ein Trägersystem entwickelt, das geeignet ist, über Rezeptoren an der Zelloberfläche die Oligonukleotid-Wirkstoffe gezielt in Tumorzellen zu transportieren. Es wurden Fusionsproteine aus dem zielerkennenden DARPin und eines Bindungspeptids für die Oligonukleotid-Komplexierung entwickelt und die einzelnen Bestandteile optimiert. Unsere Untersuchungen ergaben, dass diese Fusionsproteine Nanopartikel bilden, in denen die Oligonukleotid-Wirkstoffe durch Komplexbindung eingeschlossen sind. Auch die biochemischen Eigenschaften wie Bindungskapazität, Partikelgröße und Bindungsspezifität wurden untersucht und optimiert. Dabei erwies sich ein Tetramer aus zwei verschiedenen DARPin-Molekülen (für die Bindung an den identen Rezeptor) und einem kurzen. argininreichen Peptid als am wirksamsten. In Zellkulturmodellen konnte die spezifische Aufnahme fast ausschließlich in Tumorzellen nachgewiesen werden. Die so transportierten Oligonukleotid-Wirkstoffe resultierten in erfolgreicher Hemmung des Zielgens.