EMINA

Neuroacanthocytose (NA) ist eine seltene, neurodegenerative Erkrankung, bei der sternförmige, rote Blutzellen (RBC) auftreten, die als Acanthocyten bezeichnet werden. Diese Blutzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Diagnose von NA; es ist jedoch nichts über die molekularen Mechanismen bekannt, die zu ihrer Bildung führen. Ebenso ist nichts über die Mechanismen bekannt, die zur NA-spezifischen Neurodegeneration führen. NA- assoziierte Mutationen in den Genen von VPS13A/Chorein und Kx (Kell Blutgruppensystem) wurden kürzlich identifiziert. Beide Gene werden sowohl im Gehirn, als auch in den RBC exprimiert, aber die funktionelle Relevanz für die NA-Erkrankung ist nicht klar. Die Zellmembran der normalen RBC wird während der terminalen Erythropoese massiv verändert, vor allem durch Autophagie. Ein Defekt während dieses Prozesses führt zu einer abweichenden Morphologie, wie bei der Acanthocytose. Autophagie spielt auch eine wichtige Rolle bei der Entfernung von toxischen Proteinaggregaten in Nervenzellen. Ein entsprechender Defekt führt letztlich zur Neurodegeneration. Daher stellen wir die Hypothese auf, dass die Defekte in VPS13A oder Kx einen Einfluss auf die Autophagie haben und für beide Krankheitsbilder im Gehirn und in den RBC verantwortlich sind. In diesem Projekt werden wir uns auf die Membran der RBC als Modellsystem fokussieren, um die grundlegenden Mechanismen der NA-Erkrankung zu untersuchen. Die NA-Acanthocyten zeigen eine stabile, sternförmige Morphologie und das lässt auf eine stabile Heterogenität in der Acanthocytenmembran schließen. Diese Heterogenität kann auf große Membrandomänen zurückgeführt werden, die wahrscheinlich durch Assoziation von Membranprotein- und Lipid-Komplexen, gemeinsam mit dem Cytoskelett, gebildet werden. Daher planen wir im ersten Ansatz, einige relevante Membranmarker auf NA- Acanthocyten und normalen RBC mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) zu analysieren und zu vergleichen. Speziell sollen die Verteilungen von Gerüstproteinen und anderen Membran-Komponenten, die zu hochmolekularen Komplexen aggregieren, untersucht werden. Dabei werden auch die (normalen und defekten) Proteine VPS13A und Kx lokalisiert. Als Ergebnis dieser Studien erwarten wir, Marker für die Acanthocyten- Membrandomänen zu erhalten. In einem zweiten Ansatz werden wir biochemische Methoden verwenden, um die Acanthocyten-Membrandomänen zu isolieren, indem wir die Membranen solubilisieren und in einem Dichtegradienten durch Zentrifugation trennen und fraktionieren. Die Komposition der einzelnen Fraktionen wird durch Immunblot-Analyse und Massenspektrometrie bestimmt. Wir werden uns speziell auf die Verteilung der Marker für Acanthocyten-Membrandomänen konzentrieren und deren mögliche Wechselwirkungen mit VPS13A und Kx untersuchen. Die assoziierten Proteine werden durch Immunpräzipitation und Proteom-Analyse identifiziert werden. Diese Informationen können bereits mechanistische Einsichten ergeben. In einem dritten Ansatz planen wir, die Rolle von VPS13A und Kx in der terminalen Erythropoese zu untersuchen, besonders im Hinblick auf ihre Verknüpfung mit der Autophagie. Unsere Hypothese ist, dass VPS13A eine Rolle als "tethering component" bei der Verknüpfung von Autophago(lyso)somen mit anderen Kompartimenten spielt. Das mutierte VPS13A ist wahrscheinlich defekt und dadurch kann die Autophagie gestört werden und schließlich zu missgebildeten Erythrocyten führen. Das Kx Protein könnte eine Rolle bei der metabolischen Regulation der Autophagosomen- Bildung spielen. Wir planen daher, den Ablauf der Autophagie in normalen und NA-Retikulocyten zu untersuchen. Dazu sollen die bekannten Autophagosomen-Marker, sowie VPS13A und Kx mit IFM kolokalisiert und kinetisch analysiert werden. Um die Störung der Funktion von VPS13A und Kx zu untersuchen, planen wir, ihre Expression in erythroiden Vorstufen zu unterdrücken und dabei die Auswirkungen auf die Bildung und Reifung der Autophagosomen zu studieren. Bei diesen Versuchen könnte es schließlich zur Ausbildung von Acanthocyten kommen. Bei diesem Projekt ergibt sich die einmalige Gelegenheit, die biochemischen Grundlagen der NA-determinierten Acanthocyten-Bildung zu untersuchen, die auch für die Neurodegeneration relevant sein kann. Die mögliche Rolle einer defekten Autophagie bei der Entstehung der NA könnte letztendlich zur Entwicklung von Medikamenten führen, die den genetischen Defekt kompensieren.

Dieses Unterprojekt der European Multidisciplinary Initiative on Neuroacanthocytosis (EMINA) war Teil einer Untersuchung zur Aufklärung der seltenen, vererbbaren, verheerenden, neurodegenerativen Erkrankung Neuroacanthocytose (NA). Diese wird durch die Anwesenheit von abnormalen Erythrocyten mit dornförmigen Fortsätzen (sogenannte Acanthocyten) im Patientenblut erkannt. Man nimmt an, dass die gleichen Mechanismen, die zur Bildung der Acanthocyten führen, auch für die Neurodegeneration verantwortlich sind. Somit kann uns der Defekt der Erythrocyten einen Aufschluss über den neuronalen Defekt liefern. Praktisch gesehen ist es natürlich weitaus einfacher, Blutproben von Patienten zu bekommen und zu studieren, als Nervengewebe.Ein großer Vorteil dieser internationalen Kooperation EMINA war der Austausch der seltenen Blutproben innerhalb von Europa dank unserer Partner und der Patientenorganisationen NA-Advocacy, NBIA Disorders Association und Hoffnungsbaum e.V.. Wir erhielten auch Proben aus den USA und der Karibik durch den persönlichen Einsatz von Frau Dr. Claudia Roos. Sie hat die Blutproben mikroskopiert, auf Acanthocyten überprüft und die Erythrocyten-Membranproteine analysiert. Diese relativ einfachen Methoden haben aber technische Probleme mit sich gebracht, weil die NA-relevanten Proteine VPS13A und XK nur in geringer Menge exprimiert werden, die Eigenfluoreszenz der Erythrocyten sehr hoch und störend ist und die Unterschiede zwischen den einzelnen Blutspendern beträchtlich sind. Die Proteinzusammensetzung der Membrandomänen zeigte zwar große Unterschiede zwischen normalen Erythrocyten und Acanthocyten, aber auch zwischen Acanthocyten verschiedener Patienten. Daher konnte kein spezifisches Protein den Acanthocyten zugeordnet werden. Bei den Immunoblot-Analysen von VPS13A ergab sich, dass dieses Protein fest an der Membran verankert ist, jedoch kein Transmembranprotein zu sein scheint. Es ist möglich, dass VPS13A durch Palmitoylierung verankert ist. In Zusammenarbeit mit Dr. Ulrich Salzer/MFPL lag unser Hauptfokus bei den funktionellen Tests, welche klare Unterschiede zwischen Acanthocyten und normalen Erythrocyten zeigen. Dies war besonders bei der induzierten Endovesikulierung zu beobachten. Offenbar ist der zugrunde liegende Mechanismus bei den Acanthocyten blockiert und lässt auf Unterschiede bei der Regulation des Cytoskeletts schließen. Weiters ergaben Acanthocyten eine signifikant erniedrigte Reaktion bei der Lysophosphatidsäure-induzierten Phosphatidylserin-Exponierung an der Außenseite der Zellmembran und beim Calcium-Einstrom. Das deutet auf eine Veränderung eines Signaltransduktionswegs hin. Für unser geplantes Vorhaben, die Synthese der relevanten Proteine VPS13A und XK im Laufe der terminalen Erythropoese zu unterdrücken, sind wir Kooperationen mit der Blutzentrale, ÖRK, Linz und unserem Partner Dr. Mario Mairhofer (AKH/MUW) eingegangen. Dr. Mairhofer ist Experte auf dem Gebiet der Stammzellforschung und in vitro Erythropoese. Er wird die begonnenen Studien als neuer PI im Rahmen des EMINA-2 Folgeprojekts fortsetzen.