Rolle von Bcl-2 Familienmitgliedern für Mikromilieu Unterstützung von CLL

Einleitung Chronisch lymphatische Leukämie (CLL) ist eine nachwievor unheilbare Erkrankung die mit zunehmendem Alter in einer immer größer werdenden Anzahl von Patienten auftritt. Gekennzeichnet ist die Erkrankung durch ein hohes Ausmaß an Heterogenität, was sich in der klinischen Ausprägung äußert: manche Patienten zeigen einen sehr milden Krankheitsverlauf, während andere eine sehr aggressive Erkrankung aufweisen die früh zum Tod führt. Diese Heterogenität zeigt sich auch in der Biologie des Tumors. Eine Vielzahl einzelner genetischer Defekte finden sich jeweils nur in einem kleinen Teil der Patienten und erklären für sich genommen, die Aggressivität des Tumors nicht. Im Gegenteil, üben Signale aus dem Mikromilieu, bestehend aus Nicht-Tumorzellen, einen entscheidenden Einfluss auf das Voranschreiten der Erkrankung aus und sind für die Aggressivität des Tumors wohl ähnlich wichtig, wie Defekte in den Tumorzellen selbst. Für die Therapie der CLL sind daher nicht mutierte Signalwege , welche in den Tumorzellen über das Mikromilieu reguliert werden, wie etwa die Bcl-2 Familie, äußerst attraktiv. Hypothesen, Methoden und Inhalt des Forschungsprojekts In der ersten Projektperiode etablierten wir CLL Mausmodelle mit genetischen Modifikationen in der Bcl-2 Familie, entweder mit einem Funktionsverlust von proapoptotischen Mitgliedern (Bim, Puma, Bmf) oder einem Funktionsgewinn von antiapoptotischen Mitgliedern (Mcl1, Bcl2). In diesen Tieren entwickelt sich CLL zu einem aggressiveren Tumor als in herkömmlichen CLL Mäusen. Eine Überexpression von Mcl1 zB führt zu CLL Tumoren die auch in defizienten Mikromilieus in vivo und in vitro überleben können. Ähnliche Experimente sind in der zweiten Projektperiode auch für Bim, Puma, Bmf und Bcl-2 modifizierte Tumore geplant, sowohl in Transplantationsstudien in der Maus als auch in vitro, inklusive Untersuchungen zur Ausbildung möglicher Therapieresistenzen. Darüber hinaus werden wir den Zusammenhang zwischen Bcl-2 Modifikationen und Zellzyklus assoziierten Zelltod untersuchen. Um sicherzustellen dass alle Untersuchungen in Mausmodellen auch relevant für die humane Erkrankung bleiben, werden wir Protein und RNA aller Bcl-2 Familienmitgliedern in humaner CLL untersuchen und mit genetischen Defekten sowie deren Auswirkung auf Kultivierung in definierten Mikromilieus kombinieren. Schlussfolgerung Das primäre Ziel dieses Projektes ist es daher, die zurzeit bestehenden Lücken in der systematischen Erfassung der Bcl-2 Familie hinsichtlich der mRNA und Protein Expression zu füllen und das Zusammenspiel zwischen Signalen aus dem Mikromilieu und genetischen Faktoren zu ermitteln. Das klinisch relevante Langzeitziel des Projektes ist es, optimale Therapie-Kombinationen zu finden und somit die Behandlung von CLL weiter zu verbessern. Alle Ziele beinhalten die Kollaboration innerhalb der FOR 2036 Gruppe.

Das Projekt untersucht die Beteiligung von spezifischen Mitgliedern der Bcl2 Proteinfamilie in der Genese und Therapieresistenz von Chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) anhand von zwei Bcl2-Familien Proteinen. Das Bcl2-Protein Bmf, ein sogenanntes BH3-only Protein, fungiert als Stresssensor und als Überträger von Todessignalen in der Zelle. Dabei hat es normalerweise im Immunsystem nur oberflächlich untersuchte Funktionen bei der Toleranzentwicklung. Für die menschliche CLL ist eine Variante an diesem Gen als prädisponierender Faktor für die Entwicklung der Erkrankung bekannt. An CLL Mäusen mit entferntem Bmf konnten wir den Mechanismus dieser Prädisposition untersuchen. Vor der Entstehung einer CLL muss ein für die Leukämiezellen wichtiger B Zell Antigen Rezeptor (BCR) selektioniert werden. Ein zu starkes BCR Signal (zum Beispiel durch eine Autoimmunreaktivität) führt dabei zum Zelltod der Zellen. Leukämiezellen haben daher meist ein eingeschränktes BCR Signal was mit dem langsamen Wachstum der Leukämie einhergeht. Wir können nun zeigen, dass Bmf dieses Signal normalerweise kontrolliert und das bei Fehlen von Bmf (analog der niedrigeren Expression bei der humanen Variante) sich rascher eine Leukämie entwickelt, aktivere BCR Varianten ausgewählt werden und stärkere BCR Signale beobachtet werden können. Diese veränderte Signalübertragung ist im Model auch mit Resistenzen gegen aktuelle und in Entwicklung befindliche Therapien der menschlichen CLL vergesellschaftet. Analysen von Daten aus menschlicher CLL zeigen, dass ähnliche Phänomene zu beobachten sind und auch analoge Therapieresistenzen existieren dürften. Ein zweites BH3-only Protein, Puma, ist ebenfalls in der Zelltod Induktion im Immunsystem ein zentraler Faktor. Dabei ist Puma vor allem für die Verarbeitung von exogenem Stress auf die Zelle, zum Beispiel durch Chemotherapeutika, zuständig. In unserem genetischen Model können wir, im Gegensatz zum Fall bei Bmf, in Abwesenheit von Puma keine raschere Krankheitsentwicklung beobachten. Es zeigt sich auch keine veränderte BCR Selektion, sodass anzunehmen ist, dass die primäre Selektion der CLL durch Puma nicht beeinflusst wird. Die sich ohne Puma entwickelnden CLL Klone weisen aber eine höhere Abhängigkeit von Faktoren aus dem Mikromillieu auf, wie sich in Kulturen mit unterstützenden Zellen zeigt. Zusätzlich zeigt sich auch bei Verlust von Puma eine spezifische Resistenz auf einzelne klinisch verwendete Medikamente. Erste Untersuchungen an menschlichen CLL Proben unterstützen diese Befunde. Unsere Arbeiten zeigen daher, dass spezifische BH3-only Proteine stark unterschiedlichen Einfluss auf die Entwicklungsstadien der CLL haben und auch mit vorhersehbaren Resistenzen gegen CLL Therapien einhergehen. Neben der Aufklärung des Mechanismus hinter einer bekannten genetischen Neigung zur Entwicklung einer CLL können wir zusätzlich Vorhersagen zum Optimierten Einsatz von Therapeutika machen.