EpiSwitch: die Spezifität von Kohlenhydratepimerasen

Kohlenhydrate sind die strukturell vielfältigste Klasse von Molekülen in der Natur. Die biologische Funktion von Kohlenhydraten ist ebenfalls sehr divers. Eine ihrer wichtigsten Aufgaben ist jedoch die Vermittlung von biologischer Erkennung. Die Wechselwirkung von Kohlenhydraten mit anderen Biomolekülen wie zum Beispiel Proteinen ist hierbei wesentlich für die biologische Spezifität. Auf Kohlenhydraten basierende Erkennungsprozesse durchziehen alle Formen des Lebens und manifestieren sich sowohl auf subzellulärer Ebene wie auch in der komplexen Physiologie des Menschen im Zustand von Gesundheit und Krankheit. Die primäre Ebene der strukturellen Vielfalt von Kohlenhydraten ist jene der Monosaccharide, die in der zellulären Biosynthese hergestellt werden. Ausgehend von einfachen Vorläufern wie zum Beispiel UDP-Glucose, der aktivierten Form des Traubenzuckers in der zellulären Physiologie, kann strukturelle Variation vor allem durch die sogenannte Epimerisierung unter Einwirkung von Enzymen erreicht werden. Der Term Epimerisierung meint, dass die Konfiguration eines stereogenen Zentrums im Substrat, also zum Beispiel das Kohlenstoffatom 4 der D-Glucose, invertiert wird um ein neues Monosaccharid, in diesem Fall D-Galactose, zu generieren. Viele seltene "Zucker" werden in der Biologie über den Weg der Epimerisierung hergestellt. Epimerisierungen sind jedoch auch von beträchtlichem Interesse für technologische Anwendungen, da ihre Produkte in gesundheitsrelevanten Lebensmitteln, in Kosmetika und in der Medizin Einsatz finden können. Obwohl die Epimerisierung auf den ersten Blick wie eine sehr einfache chemische Umsetzung aussieht, stellt sie synthetisch eine große Herausforderung dar. Die chemische Synthese würde mehrere Schritte unter beträchtlichem experimentellen Aufwand vor allem für die Schutzgruppenchemie erfordern. Enzyme für die Epimerisierung in der Biologie werden Kohlenhydratepimerasen genannt und sie katalysieren ihre Reaktionen mit bemerkenswerter Spezifität. Kohlenhydratepimerasen wurden kürzlich aufgrund ihrer Struktur und dem Reaktionsmechanismus in Gruppen, sogenannte Epimerase Familien, eingeteilt. Die größte der so definierten Enzymfamilien, Familie CEP 1, beinhaltet Enzyme, die eine hohe Diversität an Spezifität und Reaktivität aufweisen. Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften von Vertretern der Familie CEP 1 scheinen sich auf Basis einer weitgehend konservierten Proteinstruktur und einem ebenfalls konservierten Reaktionsmechanismus entwickelt zu haben. Ein Forschungsthema von hoher Signifikanz ist daher die Aufklärung der Rolle von struktureller Variation im und um das aktive Zentrum der Enzyme im Hinblick auf die katalytische Funktion und die Spezifität. Tom Desmet (Universität Gent) und Bernd Nidetzky (TU Graz) nutzen in diesem Projekt die komplementären Expertisen in ihren Arbeitsgruppen und schlagen vor, die molekularen Determinanten von Spezifität und Reaktivität in ausgewählten Kohlenhydratepimerasen durch gezielte Mutationsanalyse sowie detaillierte kinetische und mechanistische Charakterisierung zu studieren. Neben der Etablierung von wichtigen Struktur-Funktions-Wechselbeziehungen soll das Projekt zeigen, dass eine gerichtete Spezifitätsänderung in existierenden Kohlenhydratepimerasen möglich ist. Ein erfolgreiches Projekt würde grundlegende Einblicke in eine wichtige Gruppe von kohlenhydrataktiven Enzymen liefern und könnte neue Katalysatoren für die Herstellung von seltenen Zuckern bereitstellen.

Kohlenhydrate sind essenziell für Leben. Strukturell gesehen sind Kohlenhydrate die vielfältigste Klasse an chemischen Verbindungen in der Natur. Monosaccharide sind die grundlegenden Bausteine für komplexe Kohlenhydrate wie Oligosaccharide und Glykane. Gewöhnliche Monosaccharide wie Glukose entstammen der de novo Biosynthese von Kohlenhydraten der Zelle oder werden mit Nährstoffen aufgenommen. Weniger häufige Monosaccharide wie zum Beispiel D-Galaktose und viele andere werden aus einem kleinen Pool an Vorläuferverbindungen hergestellt. Epimerisierung (chemisch: die Konfigurationsänderung an einem Stereozentrum in Diastereomeren) ist eine biologisch wichtige und synthetisch vielversprechende Transformation für die direkte Konversion von Monosaccharid Strukturen. Die biologische Epimerisierung findet typischerweise auf der Ebene von Nukleotid aktivierten Zuckern statt. Die Enzyme für die Epimerisierung (Epimerasen) beinhalten einzigartige mechanistische Prinzipien der chemischen und biologischen Katalyse. Die Bestimmungsfaktoren von Selektivität der Reaktion und Spezifität für Substrate sind für Epimerasen in geringem Maß bekannt. Die Entdeckung von neuen, natürlichen oder "engineerten" Epimerasen mit erweitertem Substrat- und Reaktionsspektrum für die verwendeten Zuckernukleotide kann für die mechanistische Untersuchung ein wichtiger Beitrag sein. Gleichzeitig kann damit die Entwicklung neuer Anwendungen der Epimerasen begründet und unterstützt werden. Das Projekt EpiSwitch hat Zuckernukleotid abhängige Epimerasen und deren verwandte Enzyme (Dekarboxylasen) in spezieller Hinsicht auf Struktur, Mechanismus und Funktion untersucht Gemeinsame Forschung der Partner in Belgien und Österreich führte zur Entdeckung und Charakterisierung einer neuen, thermostabilen C2 Epimerase. Dieses Enzym katalysiert die Epimerisierung am C2 von D-Glukose in sämtlichen Nukleotid aktivierten Formen des Zuckers. Die Epimerase erlaubte neue Zugänge zur Untersuchung des enzymatischen Mechanismus und erscheint als ein nützliches Werkzeug für die biokatalytische Synthese. Die Untersuchung einer UDP-Glukuronsäure 4-Epimerase und verwandten UDP-Glukuronsäure Dekarboxylasen führte zu wichtigen Entdeckungen mit hoher Bedeutung für die Entwicklung des Fachgebiets. (1) Der Mechanismus der Biosynthese des verzweigten Zuckers UDP-Apiose wurde auf Basis der Klärung von Struktur und katalytischer Funktion von UDP-Apiose/UDP-Xylose Synthase aus Arabidopsis thaliana entschlüsselt. (2) Der Mechanismus der C4 Epimerisierung von UDP-Glukuronsäure wurde durch detaillierte biochemische Charakterisierung und strukturelle Untersuchung einer bakteriellen Epimerase aus Bacillus cereus aufgeklärt. (3) Der katalytische Reaktionsweg der UDP-Glukuronsäure 4-Epimerase wurde durch experimentelle und rechnerische Methoden entschlüsselt. Gezielt erzeugte Varianten der Epimerase sind einfache ("primitive") Formen einer UDP-Glukuronsäure Dekarboxylase, die selektiv UDP-Xylose aus UDP-Glukuronsäure herstellt. Ein erstes Beispiel einer Änderung der Selektivität ("Switch") wird damit gezeigt. (4) Eine neue mechanistische Hypothese wurde entwickelt: Epimerasen und Dekarboxylasen verwenden stereoelektronische Kontrolle um Selektivität in der Produktbildung in ihren katalytischen Reaktionen zu erreichen.