µROX - µRNA Redox cycling

Das Ziel dieses Projektes ist es eine schnelle, kostengünstige und ultrasensitive elektrochemische Lab-on-a-Chip (LOC) Plattform zu entwickeln, die simultan unterschiedliche microRNAs (RNAs) ohne Probenvorbereitung detektieren kann. Für die nächste Generation von diagnostischen und prognostischen Biomarkern haben sich RNAs, kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle, als sehr vielversprechend erwiesen. In Zentrallaboren existieren viele verschiedene Plattformen für RNA-Profiling. Allerdings sind diese aufgrund ihrer großen und teuren Gerätschaften für die Anwendung in patientennaher Labordiagnostik (POCT) nicht geeignet. Weitere Gründe sind die Notwendigkeit einer Probenvorbereitung sowie das hohe Probenvolumen. Um die Nachfrage nach tragbaren und schnellen Point-of-Care-Geräten decken zu können, ist die Realisierung einer LOC-Plattform von großer Bedeutung. Die Messung von mehreren RNAs mit schnellen Probe-zu-Ergebnis- Zeiten und geringem Probenverbrauch (z.B. Blut von einem Fingerstich) steht dabei im Vordergrund. Mikrofluidische LOC-Plattformen bieten eine Beschleunigung des spezifischen und sensitiven Nachweises verschiedener Biomarkern. Der geplante elektrochemische RNA-Sensor basiert auf der Kombination unterschiedlicher Verstärkungsmechanismen. Für die Erhöhung der Systemempfindlichkeit sind interdigitale Elektrodenarrays mit Abständen im Nanometer-Bereich notwendig. Um eine Enzym-basierte Verstärkung zu erhalten, wird die Stop-Flow-Technik angewendet. Des Weiteren wird eine Signalverstärkung durch mehrfachverzweigte DNA- oder RNA-Ketten sowie eine gezielte Oberflächenmodifizierung realisiert, die die Anzahl der Bindungsstellen bzw. Biomolekülen erhöht. Die Kombination dieser Verstärkungsansätze stellt eine drastische Erhöhung der Empfindlichkeit dar und ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Messung der RNAs ohne vorherige Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)- Techniken. Eine spezifische Anwendung für RNAs, bei der nur eine geringe Probenmenge zur Verfügung steht, ist der aggressive Gehirntumor bei Kleinkindern), bekannt als Medulloblastom (MB). Neben der histopatholgischen Klassifizierung des MB kann man dieses noch in vier molekulare Untertypen unterteilen. Eine frühe Einteilung des Tumors in die Untertypen, sowie eine rechtzeitige Erkennung eines Rückfalles erhöhen die Überlebenschancen der Patienten gravierend. Dieser Antrag befasst sich mit der Implementierung eines neuen Nachweisverfahrens für die Krebsforschung, der mehrere Fachgebiete vereint (Micro-Nanotechnologie, Mikrofluidik und Biomedizin). Eine erfolgreiche Demonstration der LOC-Plattform wird eine große Wirkung auf die klinische Diagnostik haben und wird damit eine kostengünstige und benutzerfreundliche Alternative zu Standard-PCR-Systemen und anderen Diagnosesystemen darstellen. Das Sensorsystem bietet darüber hinaus die Möglichkeit nicht nur in Blutplasma, Speichel oder Urin zu messen, sondern auch direkt in unverdünntem Serum oder sogar Vollblut.

Das Ziel dieses Projektes war es eine schnelle, kostengünstige und ultrasensitive elektrochemische Lab-on-a-Chip (LOC) Plattform zu entwickeln, die simultan unterschiedliche microRNAs (RNAs) ohne Probenvorbereitung detektieren kann. Das Projekt bestand aus drei wesentlichen Hauptgruppen: Die Herstellung des Mikrochips, das Auffinden von potenziellen Biomarkern (RNAs) für die Tumorklassifizierung und die Entwicklung einer hochsensitiven sowie selektiven Detektionsmethode. Der Mikrochip, der fingerartige Strukturen im Nanometerbereich aufweist, wird mit den Fertigungstechnologien der Halbleiterindustrie hergestellt. Diese fingerartigen Strukturen dienen als Elektroden für die elektrochemische Messung. Unterschiedlichste Materialien (Pt, Au, Carbon) wurden dabei als Elektrode verwendet und das elektrochemische Verhalten studiert. Eine spezielle elektrochemische Methode, bei der bestimmte Substanzen oxidiert und wieder reduziert wird, wurde dabei angewendet (redox cycling). Diese Substanzen verhält sich je nach Elektrodenmaterial unterschiedlich. Der Vorteil ist, dass dadurch eine Signalverstärkung gegenüber den nur oxidierten oder nur reduzierten Sensoren sich erzielen lassen. Je kleiner der Abstand zwischen den Elektroden ist, umso höher ist die Signalverstärkung. Unsere Versuche haben gezeigt, dass dies Verstärkung sehr stark von dem verwendeten Elektrodenmaterial sowie von der Substanz abhängt. Das größte konstante Signalverstärkungsfenster konnte bei Gold erzielt werden bei einer Signalverstärkung von 161. Dabei betrug der Elektrodenabstand 100 nm und als Redox Substanz kam Ferrocenemethanol (FcMeOH) zur Anwendung. Carbon als Elektrodenmaterial hingegen zeigt ein nicht konstantes Verstärkungsfenster auf, was den Einsatzbereich limitiert. Unterschiedliche Kombinationen von Redox Substanzen und Elektroden Materialen wurden untersucht, um eine maximale Signalverstärkung zu erhalten. Nicht nur die Signalversärkung steht dabei im Vordergrund sondern auch die Stabilität sowie der mögliche Messbereich. Zusätzlich wurden potenzielle Biomarker, in Summe 50 hoch aggressive Hirntumore (Medulloblastome und ETMR) von Kleinkindern, untersucht und analysierte mit einer "High Troughphut" Methode mehr als 870 Tumor assozierte RNAs pro Sample. Es wurden für beide Tumoridentitäten jeweils ein speziell hoch regulierter RNA Cluster identifiziert und in weiterer Folge auch in den Serum Proben der Patienten mit einem erhöhten Wert gefunden. Außerdem konnten die detektieren Werte auch in Korrelation mit dem Tumorverlauf gebracht werden. Je aggressiver und resistenter ein Tumor war, umso höher sind die entsprechenden RNAs im Serum der Patienten nachweisbar gewesen. Damit die RNAs detektiert werden können braucht es ein System, das die Handhabung der Flüssigkeiten übernimmt und gezielt die RNAs detektieren kann. Diese Fluidik-System (LOC) muss auch die Methode enthalten, die sehr sensitiv, sowie sehr selektive die bestimmte RNA detektiert. Dabei wurde in diesem Projekt ein neuartiges elektrochemisches System basierend auf CRISPR/Cas13a entwickelt. Damit ist es möglich sehr selektiv die gewünschten RNAs zu detektieren.