Quantifizierung von DNA und Protein-Biomarkern mittels Atomkraftmikroskopie

In diesem Projekt wollen wir die Quantifizierung von DNA- und Protein-Biomarkern unter Verwendung der Rasterkraftmikroskopie (AFM) studieren und weiter entwickeln. Die primären Ziele sind: 1) Quantifizierung von DNA-Biomarkern der chronisch-myeloischen Leukämie (LIMK1), 2) Quantifizierung von Protein-Biomarkern in einer einzelnen neuronalen Zelle, 3) zwei Typen von AFM Geräten, Nanowizard III von JPK und TREC von Keysight Technologies (Agilent) zu charakterisieren und zu optimieren. Die Gruppe von Joon Won Park (Pohang University of Science and Technology (Postech), Republik Korea) zeigte, dass die Nachweisgrenze von Biomarkern mit AFM dramatisch verbessert werden kann, wenn die gesamte Fläche eines Capture-Spots mit dem Kraft-Mapping- Modus gescannt wird; die beobachtete Nachweisgrenze für das transloziert Gen (b2a2) ist dann eine einzige Kopie. Es wurde auch demonstriert, dass die Quantifizierung des Markers miR-134 in einer einzelnen neuronalen Zelle mit dem gleichen Modus möglich ist. Ein Hauptziel dieses Forschungsvorhabens ist es, die wichtigen Protein-Biomarker LIMK1 von einer einzelnen Zelle zu quantifizieren. Zu diesem Zweck wird ein kleiner Spot (5 Mikrometer im Durchmesser) eines Fänger- Antikörpers hergestellt. Die Gruppe von Park wird dabei verschiedene Parameter des AFMs Nanowizard III prüfen, während die Gruppe von Peter Hinterdorfer (Johannes Kepler Universität Linz (JKU), Österreich) Biomarker-Distributionen im Nanomaßstab mit verschiedenen hochauflösenden AFM-Techniken studieren wird, die in seinem Labor entwickelt wurden, und zwar die Einzelmolekülkraftspektroskopie und die molekulare Erkennungs-Mikroskopie (TREC). Die Zugänglichkeit der Affinitätstags wird dabei durch Einzelmolekülkraftspektroskopie-Studien überprüft, während die molekulare Erkennungs-Mikroskope (TREC) hochauflösende Karten der molekularen Bindungsstellen mit einer Positionsgenauigkeit von wenigen Nanometern liefert. Die Kombination dieser hochauflösenden Rasterkraftmikroskopie-Techniken bietet eine einzigartige Möglichkeit für den Nachweis von spezifischen molekularen Bindungsstellen mit bisher unerreichter Auflösung. Die gemeinsamen Anstrengungen der beiden Gruppen werden tiefes Verständnis über die molekularen Erkennungsprozesse erbringen und die Rasterkraftmikroskopie als Werkzeug für die hochempfindliche Detektion von Biomarkern entwickeln. PR_Abstract_deu

Unser übergeordnetes Ziel war: (I) die Etablierung des Rasterkraftmikroskops als Instrument zur Quantifizierung von DNA- und Protein-Biomarkern ohne Amplifikation oder Fluoreszenzmarkierung, (II) das Verständnis des molekularen Erkennungsprozesses während der lateralen Scannung und (III) die Suche nach den effektivsten Scannungs-Modi für hohe Zuverlässigkeit und kurze Scanzeiten. Zu diesem Zweck nutzten und testeten wir die in Parks Gruppe in Korea und Hinterdorfers Gruppe in Österreich etablierten Methoden und entwickelten diese Strategien in einem kollaborativen und synergetischen Ansatz weiter. Schließlich haben die gemeinsamen Bemühungen der beiden Gruppen zu einem tieferen Verständnis des molekularen Erkennungsprozesses geführt, das AFM als Werkzeug für die hochempfindliche Quantifizierung von Biomarkern ohne Verstärkung etabliert und die effektiven und zuverlässigen Ansätze für den Einsatz in einer breiteren Gemeinschaft durch die Umsetzung unserer Änderungen verdeutlicht.