Hemmung der FOXO3-DNA Interaktion durch kleinmolekulare Inhibitoren

FOXO Transkriptionsfaktoren spielen ein essentielle Rolle bei programmiertem Zelltod und Stress- Resistenz und fungieren auch als Longevity Faktoren in der Zelle. Obwohl ursprünglich als Tumorsuppressorproteine beschrieben, sieht man FOXO Transkriptionsfaktoren heute eher als Homeostasis-Regulatoren, die in manchen Krebsarten auch zur Metastasierung, zur Vermehrung der Tumorstammzellen und zur Chemotherapie-Resistenz beitragen. Bis heute wurden keine kleinmolekularen Substanzen beschrieben, die direkt an FOXO- Transkriptionsfaktoren binden und ihre Aktivität modulieren können. Mit Hilfe eines kombinierten Testansatzes bei dem in silico eine große Anzahl an Strukturen virtuell gescannt und die gefundenen Kandidatensubstanzen dann in zellbiologischen Systemen getestet wurden, konnten wir erstmals kleinmolekulare Substanzen identifizieren, die mit dem DNA-bindenden Bereich von FOXO3 interagieren und effizient seine transkriptionelle Aktivität hemmen. Die weitere Charakterisierung dieser Substanzen ist nur durch eine internationale Kooperation verschiedener Disziplinen, im Falle dieses Projektes Bio-Medizin, Biophysik, Strukturbiologie und organische Chemie möglich. Im vorgeschlagenen multidisziplinären Forschungsprojekt möchten wir die Art der Bindung an FOXO3 und die Wirkweise dieser derzeit einzigartigen Substanzen definieren und zugleich chemische Derivative mit optimierten Eigenschaften synthetisieren. In einem ersten Schritt werden wir die strukturelle Grundlage der Interaktion dieser Substanzen mit FOXO3 mittels NMR Spektroskopie aufklären. Basierend auf den Erkenntnissen dieser Strukturaufklärung werden die Substanzen chemisch optimiert, um ihre FOXO3-inhibierende Aktivität und Löslichkeit zu maximieren. Parallel dazu werden wir an diesen Substanzen studieren, wie sie die Aktivierung von Zielgenen des Transkriptionsfaktors FOXO3 beeinflussen und ob sie FOXO3- mediiertes Überleben von Krebszellen unter Chemotherapie in vitro und in vivo verhindern können, so dass sie als FOXO3-spezifische Therapeutika in der personalisierten Krebstherapie eingesetzt werden können. Die Aufklärung der Art und Weise, wie die von uns entdeckten Substanzen an FOXO3 binden und die Herstellung chemischer Derivative mit optimierten Eigenschaften wird signifikant zum Verständnis beitragen, wie Transkriptionsfaktoren durch kleinmolekulare Substanzen moduliert werden können. In biologischen Modellsystemen werden wir analysieren wie die von uns gefundenen und optimierten Substanzen als Therapeutika für jene Krebsarten eingesetzt werden können, in denen FOXO- Transkriptionsfaktoren zur Chemoresistenz, zur Selbsterneuerung von Tumorstammzellen und zum Überleben der Tumorzellen unter Therapie beitragen.

Das Projekt "Inhibition of FOXO3-DNA interaction by small molecule inhibitors (INFODI)" beschäftigte sich mit der Identifizierung und Charakterisierung chemischer Substanzen, die mit der DNA-bindenden Domäne des genregulatorischen Proteins FOXO3 interagieren und seine Funktion modulieren. FOXO3, wie weitere FOXO Familienmitglieder, steuert eine Vielzahl zellulärer Funktionen und regelt dadurch das Gleichgewicht zwischen Zellteilung und Zelltod in unserem Körper. Mit Hilfe von Computersimulationen konnten wir in Strukturdatenbanken Kandidatensubstanzen identifizieren, deren Bindung an FOXO Proteine nachweisen, sowie deren Effekt auf die Genregulation and das Wachstum von Tumoren untersuchen. Durch eine Kombination von struktur- und molekularbiologischen Methoden konnten wir die Wirkweise dieser Substanzen näher definieren und damit weltweit als Erste Wirkstoffe beschreiben, die mit hoher Spezifität an FOXO3 binden und seine Funktion steuern. Mit unseren Partnern an der Tschechischen Akademie der Wissenschaft und an der Karls Universität in Prag entwickelten wir basierend auf den in silico gefundenen Kandidatensubstanzen neue, optimierte Derivate, die biologische Aktivität im sub-mikromolaren Bereich aufweisen. Eine entsprechende Arbeit ist derzeit zur Publikation eingereicht. Üblicherweise werden neue Substanzen an Versuchstieren getestet, um Toxizität und Wirkung zu überprüfen. Zur Vermeidung und Reduktion von Tierversuchen im Rahmen der Medikamententestung entsprechend EU Verordnung 2010/63 haben wir uns im Laufe dieses Projektes weiters auf den Biodruck menschlichen Tumorgewebes konzentriert. Wir konnten eine Methode entwickeln, bei der wir Tumore inklusive umgebendem Bindegewebe in Laser-gefertigte "fluidic chips" drucken und die dafür verwendete Biotinte so modifizieren, dass sich in ihr spontan Blutkapillaren bilden. Dieses menschliche Gewebemodell wurde kürzlich im renommierten Journal "Biofabrication" publiziert, ein entsprechendes Patent beim Europäischen Patentamt eingereicht. In derzeit durchgeführten Studien werden die im INFODI Projekt identifizierten Substanzen auf diesem Tumor-on-chip Modell getestet, womit wir deren Toxizität, deren Wirkung auf Krebswachstum, auf die für Tumorwachstum essentielle Blutgefäßversorgung und auf Metastasierung von Tumorzellen direkt in menschlichem, 3D gedruckten Gewebe analysieren können. Obwohl auch 3D biogedruckte Gewebemodelle nicht die ganze Komplexität menschlichen Gewebes widerspiegeln, stellen sie trotzdem eine hochrelevante Alternative zu Tierversuchen dar und umgehen auch evolutionäre Unterschiede zwischen Menschen und Versuchstieren, die ansonsten häufig zum Scheitern in der Medikamentenentwicklung führen. Damit hat das Projekt INFODI nicht nur das ursprünglich gesetzte Ziel der Identifizierung chemischer FOXO-regulierender Substanzen erreicht, sondern auch noch zusätzlich die Entwicklung neuer 3D Biodruckverfahren zur Vermeidung von Tierversuchen in der Medikamententestung ermöglicht.