Bildung von höher hydroxylierten Flavonolen

Das Projekt Bildung von höher hydroxylierten Flavonolen beschäftigt sich mit der Entstehung der komplexen Substitutionsmusters von Flavonolen, die physiologisch bedeutende bioaktive Substanzen in Pflanzen und pflanzlicher Nahrung sind. Das Konsortium besteht aus zwei Partnern mit einzigartigem komplementärem Know-how. Das österreichische Team hat langjährige Erfahrung in der Aufklärung von bislang unbekannten Biosynthesewegen und in der Charakterisierung der einzelnen Schritte auf der Ebene von Enzymen und den dafür codierenden Genen in einem breiten Spektrum von Nutzpflanzen. Das französische Team hat in den letzten Jahren die Entwicklung spezieller Methoden initiiert um polyphenolbasierte Affinitätschromatographie durchführen zu können. Flavonole werden wegen ihres Vorkommens in Nahrungsmitteln und Getränke als bedeutende Komponenten eingestuft, die für die menschliche Gesundheit im Rahmen einer gesunden Ernährung eine wichtige Rolle spielen. In der Pflanze selbst erfüllen sie wichtige physiologische Funktionen unter anderem für Pflanzenwachstum, Pollenfruchtbarkeit, Bestäuberanlockung und Schutz vor abiotischem Stress. Das Substitutionsmuster der Flavonolgrundstruktur scheint eine wichtige Rolle für die gesundheitlicher Wirkung zu spielen. Daher sind Flavonole mit spezifischem Substitutionsmuster (Hydroxylierung, Glucosylierung, Methylierung) von speziellem Interesse. Das Wissen über die Bildung von höher hydroxylierten Flavonolen, die im A Ring zusätzliche Hydroxylgruppen an der Position 6 oder 8 aufweisen, ist beschränkt. Während die enzymatischen Schritte wenigstens teilweise erforscht sind, sind die dafür verantwortlichen Gene unbekannt. Das Ziel des österreichisch-französischen Konsortiums ist die vollständige Aufklärung des Biosynthesewegs durch einen kombinierten chemisch-proteomischen und molekularbiolo- gischen Ansatz. Da die Gene mit gängigen Methoden nicht isoliert werden können, werden die von ihnen codierten Proteine durch Interaktion mit Flavonolen angereichert, isoliert und identifiziert. Die ermittelten Proteinsequenzen werden zur Isolierung der Gene genutzt. Zunächst werden verschiedene Flavonol-Sonden hergestellt und mit Hilfe von rekombinanten Proteinen aus der Flavonoidbiosynthese auf ihre Effektivität und Selektivität getestet. Dabei werden speziell auch membrangebundene Enzyme getestet, da die Hydroxylierungsschritte an den Positionen 6 und 8 von Membran assoziierten Enzymen katalysiert werden. Blütenblätter von Chrysanthemum segetum sollen zur Erforschung der Bildung von 8-Hydroxyflavonolen (Gossypetin) herangezogen werden und für die Untersuchungen zur Bildung von 6-Hydroxyflavonolen (Quercetagetin) können Blütenblätter von Tagetes sp. und Rudbeckia hirta genutzt werden. Die Gene und Proteine sollen anschließend im Detail untersucht werden. Die Ergebnisse sollen exemplarisch die Vorzüge eines chemischen Proteomansatzes mittels polyphenol basierender Affinitätschromatographie aufzeigen, die es erlaubt, Fragestellungen zu bearbeiten, die mittels herkömmlichen biochemischen und molekularbiologischen Methoden nicht lösbar sind. Dies wird erstmals die Identifizierung von bislang unbekannten Genen, die für die Bildung von höher hydroxylierten Flavonolen führt, ermöglichen. Die im Rahmen des Projekts erstmals produzierten rekombinanten Proteine können darüber hinaus zurbiotechnologischen HerstellungvonFlavonoiden mit unterschiedlichem Substitutionsmuster genützt werden, um das Potential einzelner Verbindungen als Leitsubstanz für die pharmazeutische Industrie oder als bioaktive Sekundärmetaboliten evaluieren zu können.

Flavonole sind wegen ihres Vorkommens in Nahrungsmitteln und Getränke bedeutende Inhaltsstoffe und spielen im Rahmen einer gesunden Ernährung für die menschliche Gesundheit eine große Rolle. In der Pflanze erfüllen sie wichtige physiologische Funktionen unter anderem bei Pflanzenwachstum, Pollenfruchtbarkeit, Bestäuberanlockung und Schutz vor abiotischem Stress. Das Substitutionsmuster der Flavonolgrundstruktur scheint eine wichtige Rolle für die gesundheitlicher Wirkung zu spielen. Daher sind Flavonole mit spezifischem Substitutionsmuster (Hydroxylierung, Glucosylierung, Methylierung) von speziellem Interesse. Das Projekt beschäftigte sich mit der Entstehung der komplexen Substitutionsmusters von Flavonolen. Das Ziel des österreichisch-französischen Konsortiums war die vollständige Aufklärung des Biosynthesewegs durch einen kombinierten chemisch-proteomischen und molekularbiologischen Ansatz. Die Zielproteine sollten dabei durch Interaktion mit Flavonolen angereichert, isoliert und identifiziert werden. Die ermittelten Proteinsequenzen sollten zur Isolierung der Gene genutzt werden. Das Konsortium bestand aus zwei Partnern mit einzigartigem komplementärem Know-how. Zunächst wurden verschiedene Flavonol-Sonden hergestellt und mit Hilfe von rekombinanten Proteinen aus der Flavonoidbiosynthese auf ihre Effektivität und Selektivität getestet. Dabei wurden speziell auch membrangebundene Enzyme getestet, da einige der Zielproteine zu membrangebunden vorliegen. Für die Studien wurden Blütenblätter von Chrysanthemum segetum zur Erforschung der Bildung von 8-Hydroxyflavonolen (Gossypetin) und von Tagetes sp. und Rudbeckia hirta für die 6-Hydroxyflavonolbiosynthese (Quercetagetin) verwendet. Parallel dazu wurden durch Transkriptomanalysen Kandidatengene für Flavonol-6-Hydroxylasen (F6H) aus beiden Pflanzen identifiziert. Die Gene wurden anschließend isoliert und rekombinant in Hefe exprimiert. Das resultierende rekombinante Protein war funktionell aktiv und zeigten hohe Spezifität für Flavonole. Darüber hinaus wurden qPCR-Studien durchgeführt, um die Expression der Gene in R. hirta-Blütenblättern zu analysieren. Die Ergebnisse belegen exemplarisch die Vorzüge eines chemischen Proteomansatzes mittels polyphenol basierender Affinitätschromatographie, die es in Zukunft erlauben wird, Fragestellungen zu bearbeiten, die mittels herkömmlichen biochemischen und molekularbiologischen Methoden nicht lösbar sind. Die im Rahmen des Projekts erstmals produzierten rekombinanten Proteine können zur biotechnologischen Herstellung von Flavonoiden mit unterschiedlichem Substitutionsmuster genützt werden, um das Potential einzelner Verbindungen als Leitsubstanz für die pharmazeutische Industrie oder als bioaktive Sekundärmetaboliten evaluieren zu können.