In vitro Rekonstitution der Protein Sekretion des Type 3 Sekretionssystems

Das Typ 3 Sekretionssystem (TTSS) ist eine hochkomplexe Proteinexportmaschinerie, die die Form einer Injektionsnadel - jedoch auf molekularer Ebene - besitzt und Injektisom genannt wird. Viele pathogene Bakterien, wie z. B. Yersinien, Shigellen, Pseudomonas, enteropathogene E. coli als auch Salmonellen, die oft milde aber auch lebensbedrohliche Krankheiten aufgrund mangelnder hygienischer Massnahmen auslösen, benötigen das TTSS, um gezielt spezifisiche, bakterielle Giftstoe direkt in Wirtszellen einzuschleusen und so den weiteren Infektionsweg vorbereiten. Um die Pathogenese und den Infektionsweg besser zu verstehen, ist eine detailreiche Kenntnis der molekularen Mechanismen des Toxintransportes notwendig. In den bisherigen Forschungen hat man sich aufgrund der enormen Komplexität des TTSS dabei v.a. auf die genetische und biochemische Analyse des Toxintransportes in ausschliesslich lebenden Zellen beschränkt. Um jedoch die molekularen Mechanismen des Transports bzw. der Toxinauswahl bestimmen und somit verstehen zu können, ist der Nachbau des Systems in einem Reagenzglas unumgänglich. Dies wird besonders durch die Eigenschaften der einzelnen Bausteine des TTSS und deren natürlichen Einlagerung in den beiden Membranen von Gram-negativen Bakterien als auch der Wechselwirkung mit den zytoplasmatisch vorkommenden Komponenten erschwert. In diesem Projekt versuchen wir, die langjährigen Expertisen zweier Labore in Bereichen der in-vitro Rekonstitution, Proteintransport, biochemisch und strukturelle Analyse von molekularen Mechanismen synergistisch einfliessen zu lassen. Im Speziellen wird in diesem Projekt den Fragen nachgegangen, welche minimalen Komponenten für die Funktionalität des Injektisoms notwendig sind, welche Reihenfolge der molekularen Vorgänge vorherrscht, ob der Transport energetisiert wird und wie molekularen Abläufe räumlich strukturiert sind. Neben anerkannten molekularbiologischen und biochemischen Verfahren kommen in diesem Projekt v.a. auch die bislang hochmodernsten bildgebenden Verfahren der Molekularbiologie, die Kryo Elektronenmikroskopie, zum Einsatz. Dieses Verfahren, welches vom Projektwerber in Österreich zum ersten Mal etabliert wurde, ermöglicht es, die räumlichen Strukturen von Makromolekülsystemen zu erhalten und so im Detail zu studieren.Diese neue Form der Analyse des rekonstitutierten Typ III Sekretionssystem repräsentiert möglicherweise nicht nur die Grundlage für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Bekämpfung mikrobieller Infektionen dar, sondern auch den Ausgangspunkt eines neuartigen Systems zur zielgerichteten und intrazellulären Substanzabgabe mit therapeutischer Wirkung.

Das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) ist eine Proteinstruktur, die manchen Bakterien mittels einer Nadelstruktur zur Sekretion bakterieller Proteine in die Wirtszellen dient und diese somit zu infizieren. Zu den Bakterien, die über ein T3SS verfügen gehören unter anderem Shigellen, die eine Bakterienruhr verursachen können, Yersinien, die als Überträger der Pest bekannt sind und Salmonellen, die für das Auftreten von schweren Durchfallerkrankungen bekannt sind. In diesem Projekt wurden die am Infektionsprozess beteiligten Strukturen des Nadelkomplexes im T3SS von Salmonellen näher beleuchtet. Durch den Einsatz biochemischer und genetischer Methoden wurden die Strukturen zunächst auf molekularer Ebene entschlüsselt und der Einsatz modernster Bildgebungsmethoden ermöglichte anschließend einen einzigartigen Einblick in die Struktur des Nadelkomplexes. In Zusammenarbeit mit der Universität KU Leuven (Niederlande) haben wir Nadelkomplexe zunächst biochemisch charakterisiert und einen Weg gefunden einen Baustein des Nadelkomplexes so zu stabilisieren, dass es erstmals gelungen ist diesen biochemisch zu isolieren und für strukturelle Untersuchungen einzusetzen. Der zweite Teil des Projektes beschäftigte sich mit der Entschlüsselung der Struktur von Bausteinen des Nadelkomplexes. Die angewandte Methode der Elektronen-Kryotomographie (CryoET) ist eine bildgebende Technik, die es ermöglicht aus zahlreichen Einzelaufnahmen eine hochauflösende dreidimensionale Ansicht von komplexen Makromolekülen, hier den Nadelkomplexen, zu erzeugen. Vorangegangene Arbeiten haben gezeigt, dass die Größe des Datensatzes die Höhe der Auflösung entscheidend beeinflusst. Um die Arbeitsabläufe mit diesen großen Datensätzen möglich zu machen, haben wir in einer neu etablierten Zusammenarbeit mit DESY eine Software entwickelt, die dazu dient, die Arbeit mit großen tomographischen Datensätzen zu automatisieren und so die Effizienz der Datenverarbeitung zu erhöhen. So konnte innerhalb des Projektes ein maschineller Lernalgorithmus kreiert und aufwendig trainiert werden, der die Erkennung der Nadelkomplexen aus Salmonellen sowie deren Abgrenzung zu anderen makromolekularen Komplexen ermöglicht. Die neue Software ist imstande Nadelkomplexe automatisch in 3D-Kryo-Tomogrammen zu identifizieren und für die weitere Rekonstruktion zur Verfügung zu stellen. Die Evaluation dieses Verfahren zeigte keinerlei Unterschiede zu manuellen Verfahren der Erkennung von Nadelkomplexen.