Entwicklung von human abgeleiteten Leberzelllinien für genotoxische Untersuchungen

Die derzeit geltende Gesetzeslage sieht vor, dass Chemikalien auf gentoxische Eigenschaften hin untersucht werden müssen um die Menschen vor den Konsequenzen von Erbsubstanzschäden (Auslösung von Krebs, reduzierte Fertilität, ect.) zu schützen. Derzeit werden chemische Verbindungen in einer ersten Stufe in vitro (d.h. mit Indikatorzellen) untersucht; falls positive Ergebnisse erhalten werden, führt man nachfolgend Tierexperimente durch. Aufgrund der hohen Zahl der "falsch positiven" Ergebnisse die in in vitro Experimenten erhalten werden, könnten bis 80% der Tierexperimente vermieden werden, wenn zuverlässigere Untersuchungsverfahren zu Verfügung stehen würden. Dies entspricht im EU Raum etwa 16 000 Tieren/Jahr. Die Hauptursache für die Unzuverlässigkeit der in vitro Modelle, ist die mangelnde Repräsentanz fremdstoffmetabolisierender Enzyme in den Indikatorzellen, die derzeit zur Verfügung stehen. Enzyme die Chemikalien in gentoxische und krebsauslösende Stoffwechselprodukte umwandeln bzw. diese entgiften sind derzeit nicht oder nur teilweise in den verfügbaren Zelllinien repräsentiert. Daher werden Aktivierungsgemische verwendet, die die Situation in menschlichen Körper nur sehr unvollständig reflektieren. Unter anderem fehlen diesen Zellen Enzyme die Entgiftungsprozesse katalysieren. Wir wissen aus Voruntersuchungen, dass in menschlichen Leberzelllinien die Aktivitäten fremdstoffmetabo-lisierender Enzyme teilweise vorhanden sind. Daher werden wir aus etwa 20 Linien die geeignetsten auswählen und diese auf ihre Eignung hin untersuchen, die gentoxischen Eigenschaften ausgewählter Modellsubstanzen zu detektieren (Primärscreening mit zeit- und kostengünstigen Einzelzell-geleelekrophoresetests). Parallel dazu werden wir versuchen, aus Stammzellen hepatozytenähnliche Zellen zu entwickeln, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme besitzen, auch diese werden im Primärscreening getestet. Im nächsten Schritt werden die vielversprechendsten Linien mit molekularbiologischen Methoden charakterisiert (Messung der Aktivitäten von Enzymen; Untersuchung der Expression von Proteinen-Proteomcis und der Transkription von Genen Transcriptomics- im Vergleich mit primären humanen Leberzellen). Die ausgetesteten Linien werden durch Transfektion von Genen, die für die Steuerung der Aktivitäten fremdstoffmetabolisierender Enzyme zuständig sind optimiert. Nachfolgend wird ein Protokoll für Kleinkerntests entwickelt. Dieses Verfahren wird im Rahmen der OECD Richtlinien für die routinemäßige Prüfung von Chemikalien eingesetzt. In der letzen Phase des Projekts wird die neu entwickelte Zelllinie validiert, d.h. es werden Kleinkerntests mit 20 Chemikalien durchgeführt, u.a. mit Problemsubstanzen mit denen mit etablierten Verfahren falsch positive Ergebnisse erhalten wurden. Diese Chemikalien sind in einer Tabelle enthalten, die von Experten der ECVAM entwickelt wurde, um in vitro Gentoxizitätsverfahren zu valideren, sodass unsere Ergebnisse mit jenen verglichen werden können die mit anderen Zelllinien erhalten werden. Neben der Einsparung von Versuchstieren bei Gentoxizitätsprüfungen wird es auch möglich sein, die neu entwickelte Zelllinie für die Beurteilung toxikologischer Fragestellungen einzusetzen etwa bei Untersuchungen von Kombinationswirkungen von Chemikalien (synergistische und antagonistische Effekte), da die Linie im Gegensatz zu anderen Linien die Induktion von Enzymen reflektieren wird, die derartigen Effekten zugrunde liegen können. Weitere Einsatzbereiche sind die Untersuchung akut toxischer Eigenschaften von Chemikalien und der diesen Effekten zugrunde liegenden Mechanismen sowie Untersuchungen ihrer Verstoffwechselung.

Eines der zentralen Probleme toxikologischer Untersuchungen ist die unzureichende Repräsentanz von Stoffwechselprozessen in Zelllinien, die für Experimente mit Giftstoffen/ Arzneimitteln eingesetzt werden. Dies trifft auch auf Untersuchungen neuer Chemikalien zu, die durchgeführt werden um festzustellen, ob sie das Erbgut schützen. Derartige Effekte führen zu Krebserkrankungen und auch zu Infertilität und zu Erbkrankheiten. Enzyme, die DNA schädigende Chemikalien aktivieren bzw. entgiften sind in vielen derzeit eingesetzten Zelllinien nicht aktiv, daher werden häufig falsch positive Ergebnisse erhalten, die nachfolgende Tierexperimente erforderlich machen. Diese in vivo-Studien könnten vermieden werden, wenn zuverlässigere in vitro-Modelle zur Verfügung stehen würden. Wir untersuchten im Rahmen eines bilateralen Projektes (in Kooperation mit dem Nationalen Institut für Biologie in Ljubljana) 12 menschliche Leberzelllinien auf ihre Fähigkeit, DNA-schädigende Kanzerogene zu detektieren. Eine der Linien (Huh6) erwies sich als besonders geeignet, d.h. sie "erkannte" krebserregende Substanzen besser als andere Zelllinien die derzeit eingesetzt werden und die Zahl der falsch-positiven Resultate war ebenfalls niedriger. Vergleiche mit den Ergebnissen von tierexperimentellen Studien, in denen DNA-Schäden im Knochenmark gemessen wurden (das häufigste in vivo-Verfahren mit Labornagern) zeigten, dass Untersuchungen mit der Zelllinie Huh6 zuverlässigere Ergebnisse erzielte. Wir haben im Rahmen der Realisierung des Projektes ein Modell entwickelt, dass in Zukunft für Chemikalienuntersuchungen eingesetzt werden kann und es gibt Hinweise darauf, dass es maßgeblich dazu beitragen könnte, die Zahl der Versuchstiere bei routinemäßigen Substanzprüfungen zu reduzieren. Darüber hinaus kann die Zelllinie auch für akute Toxizitätsuntersuchungen und für Metabolisierungsstudien von Xenobiotika eingesetzt werden. Die von uns im Rahmen des Projektes erarbeiteten Ergebnisse wurden in mehreren Top-Fachzeitschriften veröffentlicht.